影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率因素的研究.pdf

1、大豆是世界上最重要的糧油作物之一，因此其再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化的研究一直受到學者們的廣泛關(guān)注。大豆的遺傳轉(zhuǎn)化雖然取得了一定的成果，但是仍存在很多困難，大大限制大豆分子育種的效率與功能基因組的研究。因此，建立一種高效而穩(wěn)定的大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系是非常必要的。 為了建立高效大豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，本文首先利用我國栽培種大豆品種，以成熟子葉節(jié)為外植體進行了大豆高頻再生體系的建立研究；然后以萌發(fā)1d的半片種子為目標組織，在復(fù)合針針刺條件下對

2、影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的各種因素進行了分析。 大豆再生體系研究結(jié)果表明：不同基因型之間再生頻率差異較大，在所試的9個品種中，合豐25不定芽誘導(dǎo)率最高，達到77.4％；培養(yǎng)基中大量元素和微量元素的不同配比也影響不定芽誘導(dǎo)率，在1/2 MS大量元素+1/2微量元素+B5有機成分的培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)率最高，達到77.1％；誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素的最佳濃度為1.5 mg/L6-BA+.0.3 mg/LTDZ；大豆種子的萌發(fā)7d時，不定

3、芽誘導(dǎo)效率最高，為76％。 為了建立有效的潮霉素篩選體系，將農(nóng)桿菌侵染的半片種子在共培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3～5 d后，在無篩選劑的培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)3 d，然后放在含有不同濃度潮霉素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選。實驗結(jié)果表明，最適潮霉素篩選濃度為8 mg/L。 利用GUS基囪的瞬時表達效率對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素進行了研究：基因型對轉(zhuǎn)化效率有影響，在所試的6個品種中，合豐25的轉(zhuǎn)化效率最高，平均每個外植體出現(xiàn)7.3個藍色斑點

4、；采用復(fù)合針刺傷的方法可以明顯提高轉(zhuǎn)化效率，刺傷2次效查最佳,平均每個外植體上出現(xiàn)的藍色斑點數(shù)超過8.0；農(nóng)桿菌菌液濃度對轉(zhuǎn)化效率也有影響，隨著菌液濃度的增大，轉(zhuǎn)化效率有提高的趨勢，在OD<,600>=0.7時，轉(zhuǎn)化效果最高，平均每個外植體上的藍色斑點數(shù)達到8.2；共培養(yǎng)基中添加200umol/L乙酰丁香酮時，在所試的4個品種(合豐25，合豐35，合豐39，東農(nóng)42)中轉(zhuǎn)化效率均達到最高；侵染時間以30 min最佳；共培養(yǎng)時間為5 d時