農(nóng)桿菌介導(dǎo)GmPHD2基因轉(zhuǎn)化大豆的研究.pdf

1、大豆是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于受到進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆的影響，種植面積正不斷減少，我國大豆面臨嚴(yán)重的產(chǎn)業(yè)危機(jī)。針對這一難題，除了通過傳統(tǒng)育種方法增加大豆單產(chǎn)水平外，利用基因工程手段培育出抗逆新品種使之適應(yīng)不同生長環(huán)境的需要，包括各種逆境:干旱、鹽堿、凍害、低溫等，這樣就可在不與主糧爭田的情況下拓展大豆的種植面積，對提高大豆總產(chǎn)具有重要意義。
　　本實驗以浙江省杭州國家大豆分中心保存的‘浙春3號’、‘華春6號’和‘0428’為研究材料，將

2、轉(zhuǎn)錄因子GmPHD2基因克隆到兩種植物表達(dá)載體(pBA002和pES002)并分別導(dǎo)入大豆基因組中，以期獲得耐鹽性明顯提高的大豆新種質(zhì)。經(jīng)過對遺傳轉(zhuǎn)化重要影響因子及相關(guān)條件的優(yōu)化，實驗主要采用大豆子葉節(jié)和大豆下胚軸作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的外植體，取得如下主要研究成果:
　　1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系影響因素及相關(guān)條件的優(yōu)化。以‘浙春3號’，‘華春6號’，‘0428’三個大豆基因型的胚尖、子葉節(jié)和下胚軸為受體材料，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化g

3、us基因，通過對gus基因瞬時表達(dá)率的差異比較，研究了大豆遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素（基因型、外植體等），并進(jìn)一步對遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:以胚尖為受體時，三個大豆基因型在叢生芽再生部位的gus基因沒有瞬時表達(dá)，因此三個基因型都不適合應(yīng)用胚尖法。以下胚軸為受體時，外植體侵染3d后，‘浙春3號’、‘華春6號’、‘0428’在叢生芽再生部位的Ⅰ級gus瞬時表達(dá)率分別為43.92％、54.45％、58.47％，三個基因型間差異顯著。而以

4、子葉節(jié)為受體時，‘浙春3號’外植體侵染后共培養(yǎng)5d時，其叢生芽再生部位的Ⅰ級gus瞬時表達(dá)率最高，為23.05％，顯著高于‘華春6號’、‘0428’兩個基因型及其他兩個共培養(yǎng)時間（3d和4d）;同時利用‘浙春3號’對子葉節(jié)法的種子萌發(fā)時間進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)時間為3d叢生芽再生部位的Ⅰ級gus瞬時表達(dá)率以及芽誘導(dǎo)率顯著高于萌發(fā)5d。
　　2.植物表達(dá)載體pBA002-GmPHD2的構(gòu)建及對大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。利用高保真PCR酶

5、從克隆載體pMD18T-GmPHD2中擴(kuò)增出大豆PHD類轉(zhuǎn)錄因子GmPHD2，并于基因上下游分別引入XbaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn);然后通過TA克隆、載體雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段，將其連入植物表達(dá)載體pBA002，構(gòu)建了含GmPHD2基因和抗除草劑篩選標(biāo)記bar基因的植物表達(dá)載體pBA002-GmPHD2。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR檢測、雙酶切及測序驗證，表明GmPHD2基因已被完整、正確的插入到pBA002載體中，通過凍融法將重組質(zhì)粒pBA00

6、2-GmPHD2成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，之后利用優(yōu)化后的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化‘浙春3號’、‘華春6號’，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸法轉(zhuǎn)化‘0428’、‘華春6號’。轉(zhuǎn)化植株經(jīng)目的基因、篩選標(biāo)記基因PCR檢測以及草丁膦篩選，初步表明GmPHD2基因已整合到了大豆基因組中。
　　3.植物表達(dá)載體pES002-GmPHD2的構(gòu)建及對大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。將質(zhì)粒pBA002-GmPHD2和pTA2-EPSPS分別進(jìn)行酶切，回收草甘膦抗性基因

7、epsps和切去草丁膦抗性基因bar的pBA002-GmPHD2大片段，然后將兩者進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)酶切和測序證實，帶有草甘膦抗性基因epsps基因的重組質(zhì)粒pES002-GmPHD2構(gòu)建成功。之后利用優(yōu)化后的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化‘浙春3號’、‘華春6號’，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸法轉(zhuǎn)化‘0428’、‘華春6號’。通過T0代轉(zhuǎn)化植株的目的基因和篩選標(biāo)記基因PCR檢測和草甘膦篩選，以及T1代轉(zhuǎn)化植株的草甘膦篩選和分子檢測，初步表明GmPH