茄科青枯菌致病力喪失相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum)是世界上最重要的植物病原細(xì)菌之一，寄主范圍廣泛，可侵染50科450余種寄主植物。該病原菌在保存過程中易發(fā)生自然突變喪失致病力，但其機(jī)理還不清楚。本論文以分離自沙姜的茄科青枯菌自然致病力喪失突變體YC40-M作為研究對象，測定了突變體基因組全序列、篩選出突變基因、分析了5個(gè)致病相關(guān)候選基因功能，旨在揭示茄科青枯菌自然致病力喪失的分子機(jī)理，為青枯病防控技術(shù)研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)

2、果如下：
　　1．以茄科青枯菌GMI1000基因組作為參考，對沙姜青枯菌株YC40的自然致病力喪失突變菌株YC40-M及其野生型 YC40-W進(jìn)行基因組重測序分析，SNP位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，YC40-M有45745個(gè)SNP位點(diǎn)，其中同義突變19443個(gè)，非同義突變18006個(gè)；YC40-W有45745位點(diǎn)，其中同義突變19689個(gè)，非同義突變18039個(gè)。InDel位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，YC40-M有1312個(gè)InDel位點(diǎn)，其中移碼突

3、變基因323個(gè)，非移碼突變基因210個(gè)；而YC40-W有1291個(gè)InDel位點(diǎn)，其中移碼突變基因314個(gè)，非移碼突變基因208個(gè)。YC40-M與YC40-W差異位點(diǎn)1518個(gè)，非同義突變基因102個(gè)，包括堿基置換突變基因67個(gè)，移碼突變基因35個(gè)。
　　2．應(yīng)用二代高通量Illumina Miseq和第三代PacBio測序技術(shù)，對YC40-M基因組全序列進(jìn)行測定，其基因組全長為5.75Mb，包含5399個(gè)基因，4個(gè)rRNA操縱子

4、，57個(gè)tRNA，其中染色體大小為3,844,764 bp(GenBank no.CP015850)，編碼3716個(gè)基因；宏質(zhì)粒大小為1,907,366 bp(GenBank no.CP015851)，編碼1683個(gè)基因。染色體的基因中有3081個(gè)可以歸屬于COG家族，宏質(zhì)粒基因中有770個(gè)可以歸屬于COG家族，還有224個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫中沒有任何匹配。
　　3．基因敲除構(gòu)建YC40-W PhcA基因突變體YC40ΔPhcA。生物學(xué)

5、測定顯示，YC40ΔPhcA表型發(fā)生轉(zhuǎn)換，生物膜增多，運(yùn)動性增強(qiáng)，生長速率降低，生長增殖穩(wěn)定期延長，對沙姜、番茄和辣椒的致病力較野生型菌株明顯下降，驗(yàn)證了PhcA基因是參與青枯菌表型轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因。自然突變株YC40-M與YC40ΔPhcA相比，無致病力、無運(yùn)動性、不引起煙草HR反應(yīng)及在Boucher培養(yǎng)基中基本不生長。因此，PhcA參與青枯菌致病，而YC40-M與YC40ΔPhcA存在差異，說明青枯菌的自然致病力喪失除PhcA基因外還

6、有其他基因參與。
　　4． ParA2基因是細(xì)胞過程一種編碼基因，ParA2基因敲除與功能分析表明，YC40-W ParA2基因突變體菌落明顯變小，生長緩慢，胞外多糖分泌顯著減少，無流動性，生物膜形成量減少，在NA培養(yǎng)基和Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長速率均降低；突變體對沙姜的致病力明顯降低。因此，ParA2基因?qū)η嗫菥纳L、胞外多糖分泌及其致病有重要作用。
　　5．將YC40-W的RSp801、RSp931和RSc220

7、2基因分別替換為YC40-M相應(yīng)的突變基因片段，分別構(gòu)建3個(gè)基因的突變體，其中RSp801基因突變體胞外多糖分泌增加，流動性增大，菌落直徑變大，生物膜減少，在Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長速率降低；RSp931基因突變體表型無明顯變化，生物膜產(chǎn)量減少，在 Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長速率降低；RSc2202基因突變體胞外多糖分泌減少，流動性減弱，菌落直徑變小，生物膜產(chǎn)量顯著降低，在Boucher基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長速率降低。接種寄主沙姜結(jié)