青枯雷爾氏菌致病因子的分子特性及其調(diào)控研究.pdf

1、青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是世界十大重要植物病原物之一，因其分布范圍廣、寄主范圍大且具有豐富的種內(nèi)遺傳多樣性而被認(rèn)為是一個(gè)多變的復(fù)合種（species complex）。目前，在我國(guó)青枯雷爾氏菌已有向高緯度高海拔冷涼地區(qū)逐漸蔓延之勢(shì)。全基因組序列的獲得為全面解釋其在寄主識(shí)別、致病力變異、環(huán)境適應(yīng)性以及群體進(jìn)化等方面的特性提供了重要基礎(chǔ)。長(zhǎng)期以來，用于防治由該菌引起的植物青枯病的措施主要包括使用化學(xué)農(nóng)藥、

2、培育抗性品種、生物防治以及農(nóng)業(yè)防治等。由于化學(xué)藥劑防治存在諸多問題，如效果不理想、污染環(huán)境等，目前有很多關(guān)于使用綠色、環(huán)保、有效的天然活性化合物來代替的報(bào)道。但是因該菌在環(huán)境中的多態(tài)性使得迄今為止仍未找到有效的防治藥劑，造成的經(jīng)濟(jì)損失慘重。此外，不同藥劑的長(zhǎng)期使用是否會(huì)影響青枯雷爾氏菌的致病力發(fā)生變化也有待進(jìn)一步研究。本論文在對(duì)代表青枯雷爾氏菌進(jìn)行全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，分析了該菌株致病因子相關(guān)基因，并進(jìn)一步比較了全國(guó)菌株致病基因變異情況

3、。此外還探究了不同外源物質(zhì)處理對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響及對(duì)致病力的調(diào)控作用，為研究種群多樣性、致病因子變異等與生態(tài)適應(yīng)性的關(guān)系提供基礎(chǔ)，為今后青枯病的科學(xué)用藥提供可靠的理論依據(jù)。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.完成了青枯雷爾氏菌菌株CQPS-1的全基因組測(cè)序，并系統(tǒng)分析了致病因子的相關(guān)基因采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（Single molecule real-time sequencing,SMRT）對(duì)青枯雷爾氏菌CQPS-1進(jìn)行全基因組測(cè)序。

4、組裝后得到一條染色體（3.83 Mb）和一個(gè)大質(zhì)粒（2.06 Mb），基因組GC含量為66.84％。共預(yù)測(cè)到5229個(gè)編碼基因，并對(duì)基因進(jìn)行了注釋。將獲得的基因組與菌株GMI1000、YC45、Y45、FQY_4、CFBP2957、PO82、CMR15和PSI07進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，結(jié)果表明，菌株CQPS-1與4株演化型Ⅰ菌株（YC45、FQY_4、Y45、GMI1000）相比，有16個(gè)特有基因家族，共包括基因442個(gè)；與其他演化型

5、菌株（CFBP2957、PO82、CMR15、PSI07）相比，有10個(gè)特有基因家族，共包括基因625個(gè)。與GMI1000相比，菌株CQPS-1的III型分泌系統(tǒng)（T3SS）基因簇較為保守，而且除部分III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因（如RipAA，RipB和RipG7）存在一定差異外，其他致病相關(guān)基因均較保守。其中，效應(yīng)子基因RipAA出現(xiàn)顯著變異。
　　2.比較了全國(guó)煙草青枯雷爾氏菌的致病因子相關(guān)基因，明確了各個(gè)致病因子相關(guān)基因的變異

6、情況以菌株CQPS-1作為參考基因組，利用HiSeq4000（Illumina）對(duì)全國(guó)煙草青枯雷爾氏菌的106株代表菌株進(jìn)行基因組重測(cè)序，并分析菌株中致病相關(guān)基因的變異情況。結(jié)果表明，106個(gè)代表菌株基因組與參考菌株CQPS-1基因組比較共有約64,741個(gè)SNP，2,977個(gè)InDel，平均每個(gè)菌株獲得371個(gè) SV變異。所分析的致病因子相關(guān)基因中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因相對(duì)于其他類的致病基因，存在更多類型的InDel突變，而與GMI

7、1000相比差異最大的效應(yīng)子基因RipAA的編碼區(qū)域在全國(guó)煙草青枯雷爾氏菌中變異較小，僅存在一個(gè)SNP位點(diǎn)變異。
　　3.測(cè)定了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制生長(zhǎng)作用和抑菌效果，明確了這些藥劑對(duì)該菌致病力的影響采用平板帶藥法測(cè)定了外源物質(zhì)對(duì)青枯雷爾氏菌的菌落生長(zhǎng)情況，由結(jié)果可知，兩種外源物質(zhì)對(duì)青枯雷爾氏菌菌落的大小均有一定影響。利用濁度法確定了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯的IC50分別為0.38 mg/L和133.8

8、7 mg/L，然后以此濃度分別制備帶藥培養(yǎng)基，對(duì)青枯雷爾氏菌CQPS-1進(jìn)行長(zhǎng)期的繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察其致病力變化情況。通過回接實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，農(nóng)用硫酸鏈霉素繼代培養(yǎng)30次和60次后，菌株的致病力在一定程度上有增強(qiáng)趨勢(shì)：培養(yǎng)30次的菌株相較于清水處理菌株致病力有顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)，繼代培養(yǎng)60次的菌株相較于未處理菌株CQPS-1致病力有顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)。而東莨菪內(nèi)酯長(zhǎng)期作用對(duì)菌株的致病力影響規(guī)律不明顯：當(dāng)東莨菪內(nèi)酯繼代培養(yǎng)30次時(shí)，雖相較于清水處理有

9、增強(qiáng)的趨勢(shì)，但是與溶劑對(duì)照相比無顯著差異；當(dāng)用東莨菪內(nèi)酯繼代培養(yǎng)60次時(shí)，與未處理菌株CQPS-1、清水對(duì)照菌株及溶劑對(duì)照菌株均無顯著性差異。
　　4.從分子水平上研究了農(nóng)用硫酸鏈霉素及東莨菪內(nèi)酯長(zhǎng)期脅迫下青枯雷爾氏菌的致病相關(guān)基因的表達(dá)情況在農(nóng)用硫酸鏈霉素長(zhǎng)期處理過程中，菌株的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子phcA表現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢(shì)，此外，胞外多糖合成相關(guān)基因在處理前期有一定程度的升高，但是處理后期差異不顯著。東莨菪內(nèi)酯處理前期，菌株的Ⅲ型

10、分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因hrpG及關(guān)鍵毒力調(diào)節(jié)子基因pehS受到一定影響，而所選取的其他主要致病相關(guān)基因受到的影響不顯著，當(dāng)繼代培養(yǎng)60次時(shí)，所有測(cè)定的致病基因變化均不顯著。
　　綜上所述，本研究基于全基因組序列，分析了我國(guó)青枯雷爾氏菌致病相關(guān)基因的差異，發(fā)現(xiàn)了部分出現(xiàn)顯著變異的基因，如RipAA，同時(shí)，從全國(guó)菌株致病因子相關(guān)基因的變異情況比較可知，與其他類的致病基因相比，Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因存在更多類型的InDel突變。外源物質(zhì)農(nóng)用硫