cAMP受體蛋白調控鼠疫耶爾森氏菌毒力的研究.pdf

1、鼠疫的病原菌是鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)，在自然界，鼠疫的主要宿主是嚙齒動物，主要通過節(jié)肢動物蚤的叮咬在宿主之間傳播。通過蚤叮咬或者其它途徑，鼠疫可以傳染給人，引發(fā)腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥鼠疫。 鼠疫菌從鼠蚤傳播到新的宿主過程中，經(jīng)歷了溫度，滲透壓，離子濃度，PH，氧等信號的改變，鼠疫菌必須適應相應的環(huán)境壓力才能存活并維持其毒力和致病性，而每個適應性反應也必然伴隨著鼠疫菌基因轉錄的改變，這體現(xiàn)在：很多特定的調控子，分別感應特

2、定的外界信號，介導特定基因(包括毒力基因)表達的上調和下調，最終組成復雜的毒力調控網(wǎng)絡，控制鼠疫菌在媒介和貯存宿主中生存能力和致病力。 cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)作為細菌調控子能調控E.coli的100多個基因，包括參與分解代謝抑制的基因。在本實驗中，構建了鼠疫菌201株的crp突變株(△crp)和回復株。通過體內外的毒力表型實驗證實了CRP的毒力調控表型。利用比較芯片表達譜分析生長在

3、TMH—1mMcAMP中的鼠疫菌201株和△crp的差異表達基因，根據(jù)E.coli CRP的基序的特點，用生物信息學的方法預測可能受CRP直接調控的靶基因38個，進一步用實時定量RT-PCR和EMSA(凝膠阻滯實驗)來驗證確定CRP的最小調控元。在此基礎上，選取水平轉移獲得的毒力相關的質?；騪la，pst和操縱子sycO—ypkA—yopJ進行精細調控機制的研究。通過體內的LacZ報告基因融合實驗證明CRP對pla，pst和ypkA有

4、直接調控作用，然后分別用引物延伸實驗(Primer extension assay)和DNaseⅠ足跡實驗(DNaseⅠfootprinting assay)確定上述毒力基因啟動子區(qū)的轉錄起始位點，核心啟動子元件和CRP結合位點序列，揭示上述基因的啟動子區(qū)的結構圖。 表型實驗顯示crp的突變在體內和體外均影響突變株的生長，體外的生長曲線顯示△crp的倍增時間長于WT，體內實驗證明皮下途徑感染時突變株的毒力比相應的野生株下降了15

5、，000多倍，而靜脈途徑感染時，突變株的毒力大約下降了40倍。因此CRP是鼠疫菌毒力所必須的，并且在皮下感染途徑中更重要。體內實驗證實crp突變株的生長減慢可能是導致兩種感染途徑中突變株毒力減弱的部分原因。而相應的回復株能恢復crp缺失株的毒力表型，達到與野生株的毒力表型一致的水平。先前的實驗證明由Pla編碼的纖維蛋白酶原激活劑能特異性的促進鼠疫菌從外周感染部位(皮下感染[跳蚤叮咬]或者吸入)擴散。以上的實驗證據(jù)都說明crp突變株中pl

6、a的表達缺失除了能降低體內的生長表型外，還能大大降低該突變株在皮下感染途徑中的毒力。 在本實驗中，用鼠疫全基因組芯片采用雙色熒光的比較芯片表達譜實驗分析生長在TMH—1mMcAMP中的鼠疫菌田鼠型的野生株和△crp，篩選出278個差異表達基因，其中△crp相比于野生株(WT)，有104個基因表達上調，174個下調。 匯總E.coli CRP結合位點，用consensus—matrix和convert—matrix程序計算

7、CRP結合序列每個位置四個堿基出現(xiàn)的權重，得到CRP結合序列的Matrix，進而用WebLogo軟件展示序列l(wèi)ogo，最終預測得到CRP結合box：TGTGA—N6-TCTCA。利用Matrix scan程序查找278個差異表達基因中的保守CRP基序，找到38個與基序匹配分值高(以8為界值)的基因作為候選可能受CRP直接調控的靶基因。后續(xù)的實時定量RT-PCR和凝膠阻滯實驗(EMSA)顯示有36個基因或者假定的操縱子受CRP直接調控，構

8、成了鼠疫菌CRP的最小調控元，其中YPO2468的芯片表達譜結果與實時定量RT-PCR不一致，而yopD雖然芯片表達譜，實時定量RT-PCR，EMSA以及足跡實驗都證實可能為CRP調控元，但引物延伸和lacZ報告基因融合實驗并未發(fā)現(xiàn)CRP對yopD有直接調控作用，因此這兩個基因不是CRP調控元。pla，pst和ypkA的lacZ融合實驗證實CRP能正調控水平獲得的質粒基因pla，pst，而負調控ypkA。通過引物延伸實驗(Primer

9、extension assay)和DNaseⅠ足跡實驗(DNaseⅠfootprinting assay)定位了pla，pst和sycO—ypkA—yopJ操縱子的轉錄起始位點，核心啟動子元件(—10和—35區(qū))和CRP結合位點，三者一起揭示了CRP與pla，pst，sycO—ypkA—yopj啟動子DNA相互作用的結構圖。 pla，pst的CRP位點均位于啟動子區(qū)—35區(qū)的上游，cAMP—CRP與啟動子DNA結合后，促進RNA

10、聚合酶的轉錄，表現(xiàn)為激活轉錄作用。 鼠疫菌中的sycO，ypkA和yopJ基因組成一個三聯(lián)體的操縱子，sycO—ypkA—yopJ操縱子上僅有一個受CRP調控的啟動子，但是啟動子上有2個CRP結合位點(位點1和位點2)，并且只在位點1上找到CRP box的同源序列，說明位點1是真正的CRP位點，而位點2應該是無效位點。而sycO的CRP位點則位于—10區(qū)的下游，阻礙了RNA聚合酶的轉錄延伸，因此表現(xiàn)為抑制調控作用。 無論

11、是CRP蛋白還是pla，pst和sycO—ypkA—yopJ啟動子區(qū)，其在4種鼠疫菌生物型中，即古生型，中世紀型，東方型和田鼠型，是相當保守的。因此，本研究中的田鼠型鼠疫菌的結果可以普遍運用于其它鼠疫生物型中。 通過上述實驗，不僅首次界定了鼠疫菌田鼠型的CRP最小調控元，推測出CRP可能的調控元。結合相應的體內外表型實驗，進一步證實并精細研究了CRP直接調控毒力基因pla，pst和sycO—ypkA—yopJ操縱子的機制。CRP