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文檔簡介
1、目的:建立鼠疫耶爾森氏菌防污染多重PCR—微孔板雜交—EIA檢測鑒定技術用于鼠疫耶爾森氏菌的快速檢測鑒定.方法:針對分別存在于鼠疫耶爾森氏菌pMT1和pPCP1質(zhì)粒上的毒力基因caf1和pla,以及一段276bp染色體序列3a分別設計引物,其中上游引物5'-末端生物素標記,建立多重PCR反應體系.用特別設計的三對引物制備捕獲探針并分別包被聚乙烯微孔板,原則是探針的長度在400—700bp之間,且包含靶序列,以提高雜交檢測效率.待鑒定標本
2、用生物素化的三對檢測引物多重PCR擴增,擴增體系中用UNG防止產(chǎn)物污染.同時檢測caf1、3a和pla三個靶序列,相應擴增產(chǎn)物大小分別為171、276和480bp.擴增產(chǎn)物熱變性后在預包被捕獲探針的微孔板中嚴格條件下分別雜交和漂洗.信號檢測系統(tǒng)采用鏈霉親和素化的辣根過氧化物酶,以TMB作為底物,顯色反應結(jié)束后,2MH<,2>SO<,4>中止反應，在Hyperion Micro4酶標儀上讀取OD450，陽陰OD比值≥2.1為陽性.結(jié)果：應
3、用該鑒定技術對中國鼠疫耶爾森氏菌17個生態(tài)型及新發(fā)現(xiàn)的青藏高原青海田鼠疫源地菌株的檢測結(jié)果表明，多重PCR-電泳法檢測結(jié)果，54株實驗菌株均擴增出預期的3條產(chǎn)物帶，相關菌株均陰性，檢測靈敏度為100fgDNA;多重PCR-微孔板雜交檢測結(jié)果，20株實驗菌株全部陽性（OD450 0.151-0.967），相關菌株均陰性（OD450 0.007-0.019）.其檢測靈敏度為10fgDNA.結(jié)論：該方法用于鼠疫耶爾森氏菌的鑒定簡便、快捷，具有
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