用4對(duì)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的:鼠疫PCR技術(shù)是1995年由中國鼠布基地引進(jìn),并在部分省區(qū)開展的分子生物學(xué)技術(shù),它是一種利用鼠疫耶爾森氏菌特定的引物對(duì)特異的DNA片斷進(jìn)行體外擴(kuò)增的檢驗(yàn)方法.目的基因往往選擇鼠疫耶爾森氏菌特異的質(zhì)粒.但是鼠疫耶爾森氏菌在自然條件下容易發(fā)生變異而變成"非典型菌",這時(shí)通過一對(duì)或兩對(duì)引物PCR的方法檢測(cè)不到菌.本文利用現(xiàn)在公認(rèn)的三對(duì)質(zhì)?；蚝鸵粚?duì)染色體基因作為靶基因來檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌,全部實(shí)驗(yàn)在4h內(nèi)全部完成,克服了"四步檢驗(yàn)法"必

2、須在24-48h才能完成所帶來診斷困難.從而探索一種鼠疫的快速診斷方法.方法: 1所用菌株是我省自19世紀(jì)50年代以來分離于河北鼠疫自然疫源地的菌株,菌株保存于真空凍干管中,顏色為淡白色.首先對(duì)菌株復(fù)活,28℃培養(yǎng)48h,再經(jīng)過1-2代使菌株復(fù)活.2我們對(duì)鼠疫耶爾森氏菌的本底信息進(jìn)行鑒定,包括糖酵解試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和毒力因子的鑒定.糖酵解試驗(yàn)用液體湯管法,生化試驗(yàn)用固體試管法,毒力因子的鑒定采用文獻(xiàn)所介紹的方法.3動(dòng)物模型選擇河北省鼠疫自

3、然疫源地主要傳播媒介突病蚤蒙冀亞種蚤,首先在疫源地收集新鮮的鼠巢進(jìn)行羽化,分類鑒定后,把突病蚤蒙冀亞種蚤單獨(dú)飼養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)材料.首先在控制條件下,叮咬感染鼠疫耶爾森氏菌的小白鼠,然后把小白鼠取出單只揀蚤.材料研碎分成2份,一份用于四步檢驗(yàn)、一份用于鼠疫PCR.4對(duì)引物的合成通過internet從DDBJ核酸網(wǎng)檢索并設(shè)計(jì).目的基因選擇編碼FI抗原的質(zhì)粒caf1基因、編碼血漿凝固酶及胞漿素原活化因子的質(zhì)粒pla基因、編碼與色素沉著有關(guān)的hms