用4對引物聚合酶鏈式反應檢測鼠疫耶爾森氏菌的試驗研究.pdf

1、目的:鼠疫PCR技術是1995年由中國鼠布基地引進,并在部分省區(qū)開展的分子生物學技術,它是一種利用鼠疫耶爾森氏菌特定的引物對特異的DNA片斷進行體外擴增的檢驗方法.目的基因往往選擇鼠疫耶爾森氏菌特異的質(zhì)粒.但是鼠疫耶爾森氏菌在自然條件下容易發(fā)生變異而變成"非典型菌",這時通過一對或兩對引物PCR的方法檢測不到菌.本文利用現(xiàn)在公認的三對質(zhì)?；蚝鸵粚θ旧w基因作為靶基因來檢測鼠疫耶爾森氏菌,全部實驗在4h內(nèi)全部完成,克服了"四步檢驗法"必

2、須在24-48h才能完成所帶來診斷困難.從而探索一種鼠疫的快速診斷方法.方法: 1所用菌株是我省自19世紀50年代以來分離于河北鼠疫自然疫源地的菌株,菌株保存于真空凍干管中,顏色為淡白色.首先對菌株復活,28℃培養(yǎng)48h,再經(jīng)過1-2代使菌株復活.2我們對鼠疫耶爾森氏菌的本底信息進行鑒定,包括糖酵解試驗、生化試驗和毒力因子的鑒定.糖酵解試驗用液體湯管法,生化試驗用固體試管法,毒力因子的鑒定采用文獻所介紹的方法.3動物模型選擇河北省鼠疫自

3、然疫源地主要傳播媒介突病蚤蒙冀亞種蚤,首先在疫源地收集新鮮的鼠巢進行羽化,分類鑒定后,把突病蚤蒙冀亞種蚤單獨飼養(yǎng)用于實驗材料.首先在控制條件下,叮咬感染鼠疫耶爾森氏菌的小白鼠,然后把小白鼠取出單只揀蚤.材料研碎分成2份,一份用于四步檢驗、一份用于鼠疫PCR.4對引物的合成通過internet從DDBJ核酸網(wǎng)檢索并設計.目的基因選擇編碼FI抗原的質(zhì)粒caf1基因、編碼血漿凝固酶及胞漿素原活化因子的質(zhì)粒pla基因、編碼與色素沉著有關的hms