鼠疫耶爾森氏菌蛋白對(duì)宿主NF-κB通路的影響及YpkA激酶活性的研究.pdf

1、目的：
　　1.病原菌的入侵通常引起宿主 NF-κB信號(hào)通路的活化，鼠疫菌蛋白 SycE、YscL、YscS是T3SS的組成成分，YscL是為T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)蛋白提供能量的YscN ATTPase的調(diào)控蛋白；YscS是分泌裝置的成分蛋白。通過檢測(cè)鼠疫菌蛋白 SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL對(duì)宿主NF-κB信號(hào)通路的影響，對(duì)初步研究鼠疫菌可能的致病機(jī)制提供依據(jù)。
　　2、YpkA是鼠疫菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)

2、效應(yīng)蛋白，VASP是人的一種細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白，通過體外驗(yàn)證YpkA對(duì)VASP的磷酸化作用，對(duì)鼠疫菌的致病可能的機(jī)制進(jìn)行初步的探討。
　　方法：
　　1. LB液體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)鼠疫耶爾森氏菌，試劑盒提取其基因組DNA。設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增yscL基因，插入pCMV-Myc質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-yscL，經(jīng)測(cè)序分析正確后大量提取質(zhì)粒，去內(nèi)毒素后用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
　　2.大量提取本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的表達(dá)S

3、ycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL的pCMV-Myc去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
　　3.利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將以上提取的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，以anti-Myc抗體為一抗，WB方法檢測(cè)以上5種蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)。表達(dá)正確后，再分別與表達(dá)螢火蟲熒光素酶的pBII-LUC質(zhì)粒和表達(dá)海腎熒光素酶的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。然后用TNF-α刺激293T細(xì)胞，在化學(xué)發(fā)光板上檢測(cè)熒光素酶的

4、活性。
　　4.在大腸桿菌BL21中表達(dá)YpkA蛋白，用Glutathione Sepharose4B?珠子純化YpkA；在293T細(xì)胞中表達(dá)VASP，F(xiàn)lag珠子純化VASP。將純化的YpkA、VASP、ATP及磷酸激酶緩沖液混合，30℃反應(yīng)30min，設(shè)立陽性和陰性對(duì)照組，分別用WB和同位素標(biāo)記法檢測(cè)VASP的磷酸化。
　　5.統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)方法為方差分析。
　　結(jié)果：
　　1.序

5、列分析結(jié)果顯示pCMV-Myc-yscL構(gòu)建正確。
　　2. WB結(jié)果顯示SycE、YPO2940、YPO3877、YscS和YscL在293T細(xì)胞中得到正確表達(dá)。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：SycE、YPO3877、YscS和YscL實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶活性比陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；YPO2940組熒光素酶活性比陰性對(duì)照組沒有降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4. WB