RovM 和 RovA 調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌生物被膜形成和毒力的分子機(jī)制研究.pdf

1、鼠疫耶爾森氏菌是（Yersinia pestis,以下簡(jiǎn)稱“鼠疫菌”）是引發(fā)烈性傳染病鼠疫的病原菌，是一種革蘭氏染色陰性的短小桿菌。而且，鼠疫菌在不同的培養(yǎng)條件或宿主環(huán)境下會(huì)呈現(xiàn)不同的形態(tài)。鼠疫菌染色體基因組大小約為4.65 Mb，包含約4000個(gè)基因。大多數(shù)的鼠疫菌菌株都包含3種質(zhì)粒：pPCP1，pCD1和pMT1，3種質(zhì)粒上包含有大量重要的毒力因子，對(duì)于鼠疫菌在宿主體內(nèi)生存、傳播以及致病有著重要意義。鼠疫菌進(jìn)入人體后，感染初期會(huì)在幾

2、天內(nèi)迅速擴(kuò)散至人體的淋巴結(jié)形成腺鼠疫（bubonic plague）；一旦進(jìn)入血液經(jīng)大量繁殖后容易引發(fā)敗血癥鼠疫（septicemic plague），并進(jìn)一步擴(kuò)散至脾、肝、肺等器官和組織；最終，一部分患者會(huì)發(fā)展為肺鼠疫（pneumonic plague），病原菌可以直接通過空氣傳播給其他人，易傳播且致死率高。鼠疫菌引發(fā)的烈性傳染病曾在世界范圍內(nèi)引發(fā)3次大流行，給人類帶來了深重的災(zāi)難，并在一定程度上影響了各民族的政治、經(jīng)濟(jì)和文化。而且，

3、近些年來世界衛(wèi)生組織（WHO）將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。鼠疫防治的研究工作仍然顯得十分重要。
　　鼠疫菌由其祖先假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis，以下簡(jiǎn)稱“假結(jié)核菌”）進(jìn)化而來，然而完全區(qū)別于假結(jié)核菌的傳播方式，在自然界中，鼠疫菌通過節(jié)肢動(dòng)物跳蚤的叮咬在宿主動(dòng)物間進(jìn)行循環(huán)傳播，攜帶病原菌的跳蚤偶然間叮咬到人類會(huì)引發(fā)人間鼠疫。鼠疫菌在跳蚤體內(nèi)傳播時(shí)，會(huì)形成致密的生物被膜堵塞跳蚤的前胃，形成所

4、謂的“菌栓”，使得跳蚤吸食的血液無法進(jìn)入胃內(nèi)消化，跳蚤時(shí)刻處于饑餓狀態(tài)，反復(fù)叮咬宿主從而促進(jìn)了鼠疫菌的傳播。因此，鼠疫菌生物被膜的產(chǎn)生對(duì)于其經(jīng)蚤傳播的能力是具有重要意義的。
　　鼠疫菌擁有復(fù)雜而精確的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制著各個(gè)生物被膜形成決定性因子以及毒力因子的激活和抑制，這其中各級(jí)調(diào)控子的協(xié)同作用對(duì)于鼠疫菌的致病和傳播有著重要意義。目前的研究表明，許多重要的調(diào)控子以及它們調(diào)控的靶標(biāo)基因在鼠疫菌生物被膜形成以及病原菌致病性中扮演著重要角色

5、。鼠疫菌中hmsHFRS操縱子坐落于染色體上的pgm位點(diǎn)內(nèi)，負(fù)責(zé)合成和運(yùn)輸多聚β-1,6-N-乙酰-D-氨基葡糖（poly-β-1,6-N-acetylglucosamine exopolysaccharide）類似的多糖化合物，是生物被膜基質(zhì)的主要成分，與鼠疫菌菌落能否被剛果紅染料染色有直接關(guān)系。環(huán)二鳥苷單磷酸（c-di-GMP）是一個(gè)在細(xì)菌內(nèi)廣泛存在的第二信使分子，影響細(xì)菌毒力因子的表達(dá)和生物被膜形成。在鼠疫菌內(nèi)，HmsT和HmsD

6、是僅有的兩個(gè)鳥苷酸環(huán)化酶能夠催化c-di-GMP的合成，從而促進(jìn)生物被膜的形成。然而，HmsP是鼠疫菌中唯一催化降解 c-di-GMP的磷酸二酯酶，從而抑制鼠疫菌生物被膜的產(chǎn)生。在革蘭氏陰性菌中，脂多糖（Lipopolysaccharide）是構(gòu)成外膜必不可少的主要成分。一般來說，脂多糖由三部分組成：脂質(zhì)A，核心多糖（Kdo）和O抗原，而鼠疫菌的脂多糖僅由脂質(zhì)A在糖基轉(zhuǎn)移酶的催化下與Kdo連接。在鼠疫菌中，waaA, waaE和coaD

7、構(gòu)成一個(gè)三基因的操縱子waaAE-coaD。waaA編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶催化Kdo連接到脂質(zhì)A上，而waaA缺失后的鼠疫菌也表現(xiàn)出明顯的生物被膜形成缺陷。waaE編碼的蛋白對(duì)于核心多糖鏈內(nèi)庚糖的修飾起到關(guān)鍵作用，而研究表明 waaE缺失后體外培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)生物被膜形成約有40％左右的降低。這說明了鼠疫菌生物被膜的形成和脂多糖的合成有著重要聯(lián)系。在鼠疫菌中，pH6抗原是重要的黏附因子以及毒力因子。pH6抗原的合成和分泌需要兩個(gè)相鄰的操縱子基因簇的

8、參與，即psaABC和psaEF。psaEF可以編碼調(diào)控子蛋白促進(jìn)psaABC的表達(dá)。重要的毒力調(diào)控子RovA和PhoP可以通過直接結(jié)合psaABC和psaEF的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)，分別激活和抑制它們的表達(dá)。pH6抗原可以通過介導(dǎo)鼠疫菌黏附到肺泡上皮細(xì)胞，對(duì)于鼠疫菌引發(fā)小鼠腺鼠疫和肺鼠疫的發(fā)生都有重要的貢獻(xiàn)。
　　RovA是 MarR/SlyA家族的調(diào)控子，影響著許多細(xì)菌大量毒力基因的表達(dá)，在三種致病型耶爾森氏菌的毒力基因調(diào)控中都扮演重

9、要角色。許多MarR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，例如表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的TcaR，屎腸球菌（Enterococcus faecium）的AsrR，變異鏈球菌（Streptococcus mutans）的RcaR以及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SarZ/SarA等，都有研究報(bào)道影響細(xì)菌生物被膜的形成，然而RovA對(duì)于鼠疫菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制還是未知的。RovM是

10、LysR家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，它首次被發(fā)現(xiàn)是在假結(jié)核菌中，研究表明RovM可以直接結(jié)合到rovA基因的啟動(dòng)子區(qū)并抑制其轉(zhuǎn)錄，而且RovM影響假結(jié)核菌的侵襲能力、毒力及運(yùn)動(dòng)性等。許多LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，例如菊歐文氏菌（Erwinia chrysanthemi）的PecT，胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）以及大腸桿菌（Escherichia coli）的LrhA，都在細(xì)菌毒力及生物被膜基因調(diào)控方面影響重大。那

11、么，RovM在鼠疫菌毒力及生物被膜形成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中又扮演怎樣的角色呢？
　　本研究中，以RovM和RovA兩個(gè)調(diào)控子作為主要的研究對(duì)象，通過生物被膜形成檢測(cè)的相關(guān)表型實(shí)驗(yàn)如：結(jié)晶紫染色半定量實(shí)驗(yàn)、線蟲蟲卵發(fā)育實(shí)驗(yàn)、菌落表面形態(tài)觀察等實(shí)驗(yàn)方法探究RovM和RovA對(duì)鼠疫菌生物被膜形成的影響。結(jié)果表明：RovM能夠促進(jìn)鼠疫菌生物被膜的形成，而RovA卻抑制鼠疫菌生物被膜的形成。通過檢測(cè)并比較鼠疫菌不同菌株之間細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GM

12、P的含量探究RovM和RovA是否影響第二信使分子c-di-GMP的合成。結(jié)果表明：RovM顯著地激活c-di-GMP的合成，而RovA卻強(qiáng)烈地抑制c-di-GMP的合成。通過皮下感染以及靜脈感染兩種方式給小鼠注射鼠疫菌，繪制小鼠生存曲線來探究RovM對(duì)鼠疫菌毒力的影響。結(jié)果表明：RovM抑制鼠疫菌的毒力。在獲得了表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，進(jìn)一步通過精細(xì)的基因調(diào)控實(shí)驗(yàn)如：引物延伸實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量熒光 PCR實(shí)驗(yàn)、LacZ報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)以及凝膠阻滯

13、實(shí)驗(yàn)等方法探究 RovM和RovA對(duì)鼠疫菌生物被膜形成以及毒力相關(guān)的靶基因和調(diào)控子基因調(diào)控的分子機(jī)制。結(jié)果表明，RovM通過激活 hmsHFRS、hmsT、hmsCDE的表達(dá)，并同時(shí)抑制 hmsP的表達(dá)促進(jìn)鼠疫菌生物被膜的形成。然而， RovM間接地抑制YPO1635-phoPQ-YPO1632的表達(dá)，卻不影響waaAE-coaD、phoPQ-YPO1632和fur的表達(dá)。RovA通過抑制hmsT、waaAE-coaD、YPO1635-

14、phoPQ-YPO1632和phoPQ-YPO1632的表達(dá)阻礙鼠疫菌生物被膜的形成。然而， RovA卻不影響hmsHFRS、hmsCDE、hmsP、fur和rovM的表達(dá)。并且，RovM通過直接抑制rovA的表達(dá)，且同時(shí)間接抑制psaABC和psaEF的表達(dá)來抑制鼠疫菌毒力。同時(shí)，RovM可以激活自身的表達(dá)，且在26℃下高表達(dá)而37℃下低表達(dá)。我們匯總本研究中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及前期的研究成果，大膽的提出了RovM和RovA在鼠疫菌致病和傳

15、播中可能存在的調(diào)控通路。在跳蚤體內(nèi)環(huán)境溫度（26℃）下，RovM處于激活狀態(tài)，它可以通過調(diào)控生物被膜形成相關(guān)決定性因子來促進(jìn)鼠疫菌生物被膜的形成，并且同時(shí)抑制RovA的表達(dá)，使得RovA作用的大量毒力因子處于被抑制狀態(tài)，從而有利于增強(qiáng)鼠疫菌經(jīng)蚤傳播的能力。當(dāng)鼠疫菌由跳蚤傳播到哺乳動(dòng)物體內(nèi)后，其生存環(huán)境由26℃轉(zhuǎn)變?yōu)?7℃，此時(shí)RovM的表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致生物被膜形成的相關(guān)決定性因子處于抑制狀態(tài)，而原本表達(dá)處于抑制狀態(tài)的RovA得到激活，