雙重分子開關(guān)CsrA-RovM反向調(diào)控假結(jié)核耶爾森氏菌生物膜和運(yùn)動(dòng)性的機(jī)制研究.pdf

1、在自然條件下，細(xì)菌以浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)兩種生長形式存在。生物膜是病原微生物在生長過程中，為適應(yīng)惡劣生存環(huán)境而聚集附著于惰性或活性材料表面所形成的細(xì)菌群。生物膜的形成使病原菌對(duì)抗生素的耐受性以及對(duì)宿主免疫防御的抵抗力大幅度提高，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床耐藥問題，因此深入揭示細(xì)菌生物膜的形成機(jī)制尤其是浮游/生物膜狀態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控機(jī)制是控制生物膜細(xì)菌的重要前提之一。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌胞內(nèi)信使分子c-di-GMP、群體感應(yīng)系統(tǒng)、全局性轉(zhuǎn)錄因子CsgD和小

2、的非編碼McaS等能夠調(diào)控細(xì)菌由浮游狀態(tài)到生物膜狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。本研究以假結(jié)核耶爾森氏菌為研究對(duì)象，通過相關(guān)分子生物學(xué)手段，探索其浮游狀態(tài)/生物膜狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制。論文主要包括以下三個(gè)方面的內(nèi)容:
　　1.通過對(duì)hDC和hmsHFRS基因的qRT-PCR檢測(cè)與啟動(dòng)子活性分析證實(shí)了RovM對(duì)flhDC和hmsHFRS基因的調(diào)控作用。同時(shí)利用EMSA和Footprinting實(shí)驗(yàn)確定了RovM在hDC和hmsHFRS啟動(dòng)子上的結(jié)合位

3、點(diǎn)。作為獨(dú)特的調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性/生物膜之間轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)，RovM對(duì)細(xì)菌胞外多糖β-GlcNAc的累積與鞭毛合成的調(diào)控取決于它在hmsHFRS啟動(dòng)子和flhDC啟動(dòng)子上結(jié)合位點(diǎn)位置，通過正調(diào)控flhDC與負(fù)調(diào)控hmsHFRS促使細(xì)菌由生物膜狀態(tài)轉(zhuǎn)入浮游生活狀態(tài)。同時(shí)，RovM通過對(duì)細(xì)菌生物膜和侵襲素調(diào)控因子RovA的調(diào)控影響細(xì)菌致病性，對(duì)細(xì)菌致病性調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。
　　2.本研究通過對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子CsrA在假結(jié)核耶爾森氏菌

4、運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成上的研究，證實(shí)了CsrA一方面可以通過激活RovM在轉(zhuǎn)錄水平上影響細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性/生物膜的轉(zhuǎn)換，另一方面能直接作用于flhDC和hmsHFRS mRNA反向調(diào)控細(xì)菌的生活狀態(tài)。進(jìn)而提出了一個(gè)CsrA-RovM雙重分子開關(guān)，協(xié)同作用在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平反向調(diào)控假結(jié)核耶爾森氏菌浮游狀態(tài)/生物膜狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，這種調(diào)控方式高效且嚴(yán)謹(jǐn)，為細(xì)菌迅速適應(yīng)環(huán)境條件的變化提供了保障。且該雙分子開關(guān)的調(diào)控方式與已發(fā)現(xiàn)的分子開關(guān)相反，主要調(diào)

5、控細(xì)菌由生物膜狀態(tài)到浮游狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。
　　3.大多數(shù)細(xì)菌在饑餓條件下形成高度活躍“覓食”狀態(tài)的細(xì)胞，但其潛在的調(diào)控機(jī)制仍然未知。本研究揭示了運(yùn)動(dòng)性和生物膜形成的調(diào)控對(duì)假結(jié)核耶爾森氏菌“覓食”狀態(tài)細(xì)胞的形成至關(guān)重要，其中Crp-CsrA-RovM通路發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。當(dāng)環(huán)境中營養(yǎng)濃度受限制時(shí)，Crp通過cAMP水平的增高而被激活，cAMP/Crp復(fù)合物依次激活CsrA和RovM。RNA結(jié)合蛋白CsrA一方面通過穩(wěn)定flhDC m

6、RNA來增強(qiáng)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，另一方面通過直接結(jié)合hmsHFRS mRNA SD區(qū)抑制hmsH的翻譯來抑制生物膜形成。同時(shí)，由CsrA激活的轉(zhuǎn)錄因子RovM通過直接激活flhDC轉(zhuǎn)錄促進(jìn)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，并直接抑制hmsHFRS操縱子的轉(zhuǎn)錄來抑制細(xì)菌生物膜形成。因此，CsrA-RovM作為雙分子開關(guān)響應(yīng)環(huán)境營養(yǎng)條件的變化，在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平協(xié)同調(diào)控細(xì)菌鞭毛的形成激活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，同時(shí)控制胞外多糖β-GlcNAc合成抑制細(xì)菌生物膜的形成，協(xié)同調(diào)控假