C型凝集素受體在耶爾森氏菌致病機制中作用的研究.pdf

1、第一部分宿主Langerin在鼠疫耶爾森氏菌致病機制中作用的研究
　　【背景與目的】
　　鼠疫耶爾森氏菌是鼠疫的致病菌，是一種革蘭氏陰性菌。鼠疫菌主要經由跳蚤叮咬而傳播，它通過皮膚進入宿主體內后，快速傳播至淋巴結，造成淋巴結壞死或進入血液向全身播散（敗血癥鼠疫），或造成肺部感染（肺鼠疫），引起的鼠疫病情發(fā)展快，死亡率高。但鼠疫菌在宿主體內快速傳播至淋巴結的具體機制尚未研究清楚。
　　鼠疫菌克服宿主皮膚屏障后，遇到朗格漢

2、斯細胞等抗原提呈細胞，這些細胞將鼠疫菌捕獲并運送至淋巴結。朗格漢斯細胞是表皮中未成熟的樹突狀細胞，特異性表達一種 C型凝集素受體——Langerin，已有研究表明 Langerin能與多種病原微生物表面的糖分子相結合。鼠疫菌是一種粗糙型菌株，即在其菌體外表面不表達O抗原，核心寡糖呈自然裸露狀態(tài)。我們前期的研究結果表明，某些粗糙型革蘭氏陰性菌的核心寡糖可以與C型凝集素受體結合。
　　在本研究中，我們觀察鼠疫菌與朗格漢斯細胞的相互作用

3、，探討 C型凝集素受體Langerin與核心寡糖的結合在鼠疫菌的侵襲和傳播中的作用。
　　【方法】
　　1.檢測粗糙型、光滑型和深度粗糙型鼠疫菌對人朗格漢斯細胞的侵襲
　?。?）用慶大霉素保護法檢測鼠疫菌 KIM10-（粗糙型，核心寡糖自然裸露）、KIM10--O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）以及KIM10--core-（深度粗糙型，核心寡糖缺失突變）對人朗格漢斯細胞的侵襲能力（此方法檢測的是侵入人朗格漢斯細胞且在

4、胞內存活的鼠疫菌）。
　?。?）用CFDA-SE標記這三種鼠疫菌，加至人朗格漢斯細胞中相互作用2 h，用臺盼藍淬滅細胞外熒光，用流式細胞術檢測熒光強度（此方法檢測的是侵入人朗格漢斯細胞內的所有鼠疫菌）。
　　2.檢測粗糙型、光滑型和深度粗糙型鼠疫菌對CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞的侵襲
　　將Langerin基因和DEC-205基因分別穩(wěn)定轉染到CHO細胞，用慶大霉素保護法檢測鼠疫菌KIM10-（粗糙型）、KIM10

5、--O+（光滑型）以及KIM10--core-（深度粗糙型）對CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞的侵襲。同時檢測這三種細菌對CHO-NEO、CHO-DEC-205穩(wěn)轉細胞的侵襲，作為對CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞侵襲的對照。
　　3.檢測核心寡糖突變株對CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞的侵襲
　　為了尋找在核心寡糖-Langerin結合中起關鍵作用的糖分子，我們用核心寡糖不同長度缺失的大腸桿菌突變株（由于目前沒有鼠疫菌核心

6、寡糖的突變株），與 CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞相互作用，找到介導此作用的糖分子。
　　4.侵襲抑制實驗
　?。?）檢測臍帶血來源的人朗格漢斯細胞（hcbLCs）和表皮來源的人朗格漢斯細胞（hLCs）表面Langerin和DC-SIGN表達水平，用抗Langerin（CD207）抗體或抗DC-SIGN（CD209）抗體與人朗格漢斯細胞作用20 min，再加入鼠疫菌KIM10-與之作用，用慶大霉素保護法檢測細菌的侵襲。

7、r>　?。?）將CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞與Langerin抗體、Langerin純化蛋白、不同的寡糖、單糖分別作用20 min，再加入鼠疫菌KIM10-與之作用，用慶大霉素保護法檢測細菌的侵襲。
　　5.檢測鼠疫菌與Langerin純化蛋白以及DC-SIGN樣分子的結合
　　分別用FITC標記的Langerin純化蛋白以及DC-SIGN樣分子Mermaid與鼠疫菌KIM10-（粗糙型）或KIM10--O+（光滑型）相

8、互作用，洗去未結合的蛋白后，用流式細胞儀檢測熒光強度。
　　6.體內研究
　?。?）用鼠疫菌KIM6+（粗糙型，核心寡糖自然裸露）或KIM6+-O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）經皮感染小鼠，24 h后處死小鼠，分離腹股溝淋巴結，比較這兩組鼠疫菌在體內傳播的能力。
　　（2）用鼠疫菌弱毒株 Y. pestis1418（粗糙型，核心寡糖自然裸露）或 Y. pestis1418-O+（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）經皮感

9、染小鼠，比較這兩組鼠疫菌對小鼠存活的影響。
　　【結果】
　　1.核心寡糖介導鼠疫菌對人朗格漢斯細胞的侵襲
　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）對人朗格漢斯細胞的侵襲能力顯著高于KIM10--O+（光滑型）以及 KIM10--core-（深度粗糙型），此結果說明核心寡糖介導鼠疫菌對人朗格漢斯細胞的侵襲。
　　2.核心寡糖與Langerin的結合介導鼠疫菌對宿主細胞的侵襲
　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）對CHO

10、-Langerin穩(wěn)轉細胞的侵襲能力顯著高于KIM10--O+（光滑型）以及 KIM10--core-（深度粗糙型）的侵襲能力，且顯著高于對CHO-NEO、CHO-DEC-205穩(wěn)轉細胞的侵襲能力。這些結果說明，核心寡糖與Langerin的結合介導鼠疫菌對宿主細胞的侵襲，Langerin是鼠疫菌的受體。
　　3.在核心寡糖-Langerin結合中起關鍵作用的糖分子
　　隨著核心寡糖長度的縮短，大腸桿菌核心寡糖突變株侵襲CHO

11、-Langerin穩(wěn)轉細胞的能力下降，說明在核心寡糖-Langerin結合中起關鍵作用的糖分子位于核心寡糖的外核（outer core）中。
　　4. Langerin抗體、Langerin純化蛋白以及某些寡糖分子對鼠疫菌與人朗格漢斯細胞及CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞的結合的抑制作用
　　加入Langerin抗體后，鼠疫菌KIM10-對人朗格漢斯細胞（hcbLCs和hLCs）的侵襲能力顯著下降。加入Langerin抗體、

12、Langerin純化蛋白以及某些寡糖分子后，鼠疫菌對CHO-Langerin穩(wěn)轉細胞的侵襲能力也顯著下降。這些結果再次驗證了Langerin是鼠疫菌的受體，核心寡糖是鼠疫菌表面的配體，核心寡糖與 Langerin的結合對鼠疫菌侵襲宿主細胞起重要作用。
　　5.鼠疫菌與Langerin純化蛋白以及Mermaid的結合
　　鼠疫菌KIM10-（粗糙型）與Langerin純化蛋白以及DC-SIGN樣分子Mermaid的結合能力顯著

13、高于KIM10-O+（光滑型），此結果再次證明Langerin是鼠疫菌的受體，且核心寡糖是Langerin的配體。
　　6.核心寡糖-Langerin相互作用對鼠疫菌在小鼠體內的傳播及對小鼠存活的影響
　　在經皮感染的小鼠模型中，鼠疫菌KIM6+-O+（光滑型）傳播至淋巴結的能力顯著低于KIM6+（粗糙型）；感染鼠疫菌Y. pestis1418-O+（光滑型）小鼠的存活時間顯著長于感染Y. pestis1418（粗糙型）的小

14、鼠。這些結果說明核心寡糖-Langerin相互作用促進鼠疫菌傳播至淋巴結的能力，影響小鼠的存活。
　　【結論】
　　本研究證實 C型凝集素受體 Langerin是朗格漢斯細胞表面鼠疫菌的受體，Langeirn與鼠疫菌表面核心寡糖的結合介導鼠疫菌對朗格漢斯細胞的侵襲，促進鼠疫菌在體內的傳播。
　　第二部分人DC-SIGN和小鼠SIGNR1在粗糙型假結核耶爾森氏菌致病機制中作用的研究
　　【背景與目的】
　　假

15、結核耶爾森氏菌是一種食源性革蘭氏陰性致病菌，在外界環(huán)境中廣泛分布，常常引起回腸炎和腸系膜淋巴結炎。假結核菌進入消化道后，穿過腸黏膜進入淋巴結，引起淋巴結和回腸末端腫大，或播散至肝、脾等遠處器官，但此過程的具體機制尚未研究清楚。
　　鼠疫菌是鼠疫的致病菌，具有極強的毒力，由假結核菌進化而來。在進化的過程中，鼠疫菌丟失了脂多糖結構最外側的O抗原，因此核心寡糖自然暴露。假結核菌在26℃（外界環(huán)境溫度）條件下表達O抗原（稱為光滑型），而在

16、37℃培養(yǎng)條件下，它的O抗原的表達受到抑制，核心寡糖暴露出來（稱為粗糙型）。核心寡糖的自然暴露是鼠疫菌和假結核菌一個重要的差別，我們認為它可能與細菌毒力的增加有關。
　　DC-SIGN是表達于樹突狀細胞表面的一種C型凝集素受體，能與多種病原微生物表面的糖分子結合。SIGNR1是小鼠表達的DC-SIGN的同源體之一。我們的前期研究表明，粗糙型大腸桿菌、淋病奈瑟氏菌等革蘭氏陰性菌的核心寡糖是 C型凝集素受體DC-SIGN的配體。

17、>　　在本研究中，我們探討假結核菌核心寡糖與DC-SIGN以及SIGNR1的相互作用，以及它對假結核菌在體內傳播的影響。
　　【方法】
　　1.體外實驗檢測光滑型和粗糙型假結核菌對人樹突狀細胞（hDCs）的侵襲能力
　?。?）用慶大霉素保護法檢測培養(yǎng)于26℃（光滑型，核心寡糖被O抗原覆蓋）或37℃（粗糙型，O抗原表達被抑制，核心寡糖暴露）下的假結核菌對hDCs的侵襲能力。此方法檢測的是侵入hDCs且在胞內存活的假結核菌

18、。
　　（2）用CFDA-SE標記這兩種假結核菌，加至hDCs中使其相互作用，用臺盼藍淬滅細胞外的熒光，用流式細胞術檢測。此方法檢測的是侵入hDCs內的所有假結核菌。
　　2.體外實驗檢測光滑型和粗糙型假結核菌對HeLa-NEO以及HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲能力
　　分別將 neo、DC-SIGN基因穩(wěn)轉到 HeLa細胞，用慶大霉素保護法檢測培養(yǎng)于26℃（光滑型）或37℃（粗糙型）下的假結核菌 Y1對HeLa-

19、NEO以及 HeLa-DC-SIGN穩(wěn)轉細胞的侵襲能力。
　　3.體外實驗檢測光滑型和粗糙型假結核菌對hDCs、人肺泡巨噬細胞和HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲能力
　　用慶大霉素保護法檢測光滑型假結核菌（26-PB1）以及粗糙型假結核菌（26-PB1?wb、37- PB1?wb和37-PB1）對人DCs、人肺泡巨噬細胞以及HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲能力。
　　4.體外實驗檢測光滑型和粗糙型假結核菌對小鼠腹腔

20、巨噬細胞以及 CHO-SIGNR1細胞的侵襲
　?。?）用慶大霉素保護法和流式細胞術檢測光滑型假結核菌（26-Y1和26-PB1）以及粗糙型假結核菌（37-Y1和26-PB1?wb）對小鼠腹腔巨噬細胞的侵襲。
　?。?）用流式細胞術檢測 CHO-SIGNR1細胞 SIGNR1的表達，用慶大霉素保護法比較粗糙型假結核菌PB1?wb對CHO-NEO和CHO-SIGNR1細胞的侵襲。
　　5.體內實驗檢測光滑型和粗糙型假結核

21、菌對小鼠腹腔巨噬細胞的侵襲。
　　將光滑型假結核菌PB1和粗糙型PB1?wb注射至小鼠腹腔，作用1.5 h后，處死小鼠，收集腹腔巨噬細胞，用慶大霉素保護法比較兩組細菌對小鼠腹腔巨噬細胞的侵襲。
　　6.體內實驗比較 O抗原表達受溫度調控的和持續(xù)性表達 O抗原的假結核菌在小鼠體內的傳播
　?。?）將O抗原表達受溫度調控的假結核菌（Y1-pBR322）和持續(xù)性表達O抗原的假結核菌（Y1-pAY100.1）灌胃至小鼠體內，作

22、用3天之后，用平皿計數(shù)法、Real-time PCR法以及小動物活體成像法比較兩組小鼠脾、肝、腸系膜淋巴結中的細菌數(shù)量；
　?。?）將帶有mCherry熒光標記的假結核菌Y1 pBR322和Y1 pAY100.1注入小鼠結扎的小腸腸腔中，作用30 min后，取腸組織做冰凍切片，用免疫熒光法觀察細菌對腸壁細胞的侵襲。
　　【結果】
　　1.假結核菌核心寡糖的暴露增強其侵襲hDCs的能力
　　培養(yǎng)于37℃條件下的假結

23、核菌（37-Y1，粗糙型）對hDCs的侵襲能力顯著高于培養(yǎng)于26℃的假結核菌（26-Y1，光滑型）。此結果說明，暴露核心寡糖增強了假結核菌侵襲hDCs的能力。
　　2. DC-SIGN是粗糙型假結核菌的受體
　　培養(yǎng)于37℃條件下的假結核菌（37-Y1，粗糙型）對HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲能力顯著高于對HeLa-NEO細胞的侵襲能力。此結果說明，DC-SIGN是粗糙型假結核菌的受體。
　　3.核心寡糖與DC-S

24、IGN的結合介導粗糙型假結核菌對人DCs、人肺泡巨噬細胞以及HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲
　　粗糙型假結核菌（26-PB1?wb、37-PB1?wb、37-PB1）對人DCs、人肺泡巨噬細胞以及 HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲能力顯著高于光滑型假結核菌（26-PB1）。同時，粗糙型假結核菌（26-PB1?wb、37-PB1?wb、37-PB1）對HeLa-DC-SIGN細胞的侵襲能力顯著高于對HeLa-NEO細胞的侵襲能

25、力。這些結果說明，核心寡糖與DC-SIGN的結合促進粗糙型假結核菌對宿主細胞的侵襲，再次證明了DC-SIGN是粗糙型假結核菌的受體。
　　4.核心寡糖與 SIGNR1的結合介導粗糙型假結核菌對小鼠腹腔巨噬細胞和CHO-SIGNR1細胞的侵襲
　　粗糙型假結核菌（37-Y1和PB1?wb）對小鼠腹腔巨噬細胞的侵襲顯著高于光滑型假結核菌（26-Y1和PB1）；粗糙型假結核菌（PB1?wb）對CHO-SIGNR1細胞的侵襲能力顯著

26、高于對CHO-NEO細胞的侵襲能力。這些結果說明，核心寡糖與SIGNR1的結合介導粗糙型假結核菌對小鼠腹腔巨噬細胞的侵襲，再次證明了 SIGNR1是假結核菌核心寡糖的受體。
　　5.小鼠體內核心寡糖與SIGNR1的結合介導粗糙型假結核菌對腹腔巨噬細胞的侵襲
　　粗糙型假結核菌在小鼠體內對腹腔巨噬細胞的侵襲能力顯著高于光滑型假結核菌。此結果說明，在小鼠體內核心寡糖與 SIGNR1的結合介導粗糙型假結核菌對腹腔巨噬細胞的侵襲。<

27、br>　　6.光滑型假結核菌在小鼠體內傳播的能力下降
　　持續(xù)性表達O抗原的假結核菌（光滑型）在小鼠體內傳播至脾、肝、腸系膜淋巴結的能力顯著低于O抗原表達受溫度調控的假結核菌（在體內O抗原表達受抑制，粗糙型）的侵襲能力，但它們對腸壁細胞的侵襲能力無明顯差別。此結果說明，在假結核菌致病過程中的某些階段，核心寡糖的暴露對細菌的傳播具有重要意義。
　　【結論】
　　人DCs細胞表面的DC-SIGN和小鼠巨噬細胞表面的SIGN