雞C型凝集素樣受體Blec結(jié)構(gòu)及功能探索.pdf

1、雞Blec基因位于主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）核心區(qū)域，不同MHC-B單倍型雞的Blec基因核苷酸序列高度保守。因編碼蛋白Blec的胞外區(qū)部分包含一個(gè)C型凝素樣結(jié)構(gòu)域(C-type lectin-like domain，CTLD)，推測(cè)可能具有C型凝集素樣受體(C-type lectin-like receptor, CTLR)功能，但并未經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)。目前Blec蛋白在

2、雞體內(nèi)的組織分布及其功能尚未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。
　　本研究以國(guó)家禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心培育的MHC-B單倍型B21雞脾臟總cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增、克隆獲得雞Blec基因的結(jié)構(gòu)保守片段(Ala59-Leu176)，插入pET-30a載體，成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-Blec。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析結(jié)果表明外源蛋白以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)鹽酸胍變性、稀釋復(fù)性及凝膠過(guò)濾層析，獲得高純度的蛋白產(chǎn)物(＞99％)。利用純

3、化的Blec蛋白免疫BALB/c小鼠，常規(guī)方法制備獲得Blec蛋白特異性單克隆抗體分泌細(xì)胞株Blec-3D3。利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)來(lái)自72周齡無(wú)特定病原體公雞的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果約1.0％的細(xì)胞表達(dá)Blec蛋白，而與CD3或CD4共表達(dá)的細(xì)胞分別占0.8％和0.86％;對(duì)12周齡無(wú)特定病原體雞進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，在法氏囊上皮、肺三級(jí)支氣管的平滑肌細(xì)胞、腎、小腸平滑肌、胸腺哈氏小體、盲腸扁桃體和脾髓質(zhì)中檢測(cè)到較強(qiáng)的特異

4、性陽(yáng)性信號(hào)，而在心臟和肝臟未檢測(cè)到。
　　用純化的Blec蛋白篩選晶體，進(jìn)行X射線(xiàn)衍射，獲得分辨率達(dá)1.1(A)的衍射數(shù)據(jù)。結(jié)構(gòu)分析顯示，Blec蛋白(Ala59-Leu176)包含兩個(gè)典型的α螺旋、兩個(gè)反向平行的β折疊及三對(duì)保守的二硫鍵（Cys62-Cys73、Cys151-Cys164和Cys90-Cys172），呈典型CTLD特征。與已解析的人和小鼠典型的C型凝集素亞群2（C-type lectin subgroup2，CL

5、EC2）家族蛋白的相似度分別為47.41％(hLLT1)、42.24％(hAICL)、42.24％(mCLEC2b)、42.24％(hCD69)、41.38％(mCLEC2g)和40.52％(hKACL)，推測(cè)Blec具有CLEC2家族蛋白類(lèi)似功能。
　　已知人和小鼠CLEC2家族為自然殺傷細(xì)胞表面受體NKRP1家族的配體。為探索Blec蛋白是否有相似的作用機(jī)制，能否與MHC-Ⅰ類(lèi)分子（MHC-Ⅰ類(lèi)分子介導(dǎo)殺傷功能）或雞C型凝集素

6、樣蛋白BNK蛋白（免疫球蛋白樣分子介導(dǎo)殺傷功能）相互作用，首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建、表達(dá)和純化了B21單倍型雞的BNK基因（獲得的外源蛋白命名為BNK21）和MHC-Ⅰ類(lèi)分子（獲得的外源蛋白命名為MHC-Ⅰ-B21）。按摩爾質(zhì)量比為1∶1孵育過(guò)夜，經(jīng)凝膠過(guò)濾層析和SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示原核表達(dá)的Blec與BNK21和MHC-Ⅰ-B21蛋白均無(wú)明顯相互作用。再利用真核表達(dá)載體分別構(gòu)建成功帶有標(biāo)簽的pCMV-Myc-Blec和