麥冬凝集素與蜘蛛抱蛋凝集素的基因克隆及序列分析.pdf

1、麥冬凝集素(OJL)是來源于百合科的具有多重生物學(xué)活性的甘露糖結(jié)合蛋白，屬于單子葉甘露糖結(jié)合凝集素。蜘蛛抱蛋凝集素也是具有多種生物學(xué)活性的甘露糖結(jié)合蛋白，在抗蟲抗腫瘤方面顯示了良好的活性，具有廣闊的運用前景。這類凝集素由于具有獨特的糖結(jié)合特異性、逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制活性和保護(hù)農(nóng)作物免受昆蟲和線蟲攻擊而引起人們濃厚的興趣。本文采用同源克隆的方法，通過對麥冬與蜘蛛抱蛋球莖RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，從Genbank上比較已登錄的百合科凝集素的

2、序列，找出其保守序列，并結(jié)合軟件設(shè)計了簡并引物，進(jìn)行3’RACE末端快速擴(kuò)增，得到了3’端的部分序列，然后根據(jù)已得到的序列設(shè)計特異性引物，應(yīng)用在cDNA的3’端隨機(jī)添加若干PolyA的方法，在cDNA模板3’端加上PolyA，再以此為模板進(jìn)行PCR，從而克隆得到了麥冬凝集素5’端的部分序列。將3’與5’序列合并，就能獲得其cDNA全長序列。 以獲得的全長cDNA序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列與百合科其他植物凝集素在Genbank中的B

3、last上進(jìn)行比較，可知麥冬凝集素的全長cDNA序列由704個核苷酸組成，開放閱讀框長513bp，編碼170個氨基酸，起始密碼子位于第46～48bp，終止密碼子位于在556～558bp處，在起始密碼子上游有一個由45個堿基組成的5’非編碼區(qū)；在終止密碼子下游有一個由146個堿基組成的3’非編碼區(qū)，包括兩個加poly(A)信號和一段真核生物mRNA所特有的poly(A)序列。通過序列的測定，發(fā)現(xiàn)OJL基因均編碼前體蛋白：含有信號肽序列、成

4、熟蛋白序列和C-末端剪切序列。該成熟蛋白由109個氨基酸組成，分子量為12．1KD。成熟蛋白在氨基酸水平上與雪花蓮凝集素同源性達(dá)70.4％，與囊絲黃精凝集素同源性為81.1％，與多花黃精凝集素同源性為83.5％與蜘蛛抱蛋凝集素第一個亞基的同源性為66.4％，與蜘蛛抱蛋凝集素第二個亞基的同源性為73.2％。在blocks數(shù)據(jù)庫(WWw.blocks fhcrc.org)中檢索OJL蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)OJL氨基酸序列中存在一個凝集

5、素功能結(jié)構(gòu)域區(qū)，并具有2個典型的甘露糖專一結(jié)合位點盒(QDNY)。成熟蛋白氨基酸中極性氨基酸占44.04％，疏水性氨基酸占30.28％，酸性氨基酸占7.34％，堿性氨基酸占2.75％。OJL的信號肽包括27個氨基酸。此基因的克隆，為深入研究OJL結(jié)構(gòu)基因，剪切機(jī)制，表達(dá)和調(diào)控機(jī)制以及OJL結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系奠定了重要的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛抱蛋凝集素cDNA全長1162bp，開放閱讀框長930bp，編碼309個氨基酸的前體蛋白，起始密碼子位于

6、38～40bp，終止密碼子位于在965～967bp處，在起始密碼子上游有1個由37個堿基組成的5’非編碼區(qū)；在終止密碼子下游有1個由195個堿基組成的3’非編碼區(qū)，其后面還有一段真核生物mRNA所特有的poly(A)序列。通過序列的分析可以發(fā)現(xiàn)該蛋白含有2個結(jié)構(gòu)域，即其前體蛋白含有：信號肽序列、亞基1、連接肽、亞基2和C--末端剪切序列。蛋白亞基1和2分別由106和108個氨基酸組成，分子量為12KD左右，等電點分別為5和7.13。在整

7、個氨基酸的組成中，亞基1的氨基酸中極性氨基酸占33.64％，疏水性氨基酸占32.76％，酸性氨基酸占10.91％，堿性氨基酸占8.81％；在亞基2中極性氨基酸占34.82％，疏水性氨基酸占35.71％，酸性氨基酸占7.14％，而堿性氨基酸同樣占6.25％。AEL與百合科其它凝集素的同源性較高，第一個亞基所編碼的氨基酸序列與雪花蓮凝集素同源性達(dá)51.8％，與囊絲黃精凝集素同源性為60.4％，多花黃精凝集素65.5％與鈴蘭凝集素第一個結(jié)構(gòu)域

8、同源性為50.0％，與鈴蘭凝集素第二個結(jié)構(gòu)域同源性為49.1％。第二個亞基的數(shù)字分別為61.6％、74.3％、77.7％、57.8％、55.7％。在大多數(shù)百合科凝集素中，通常都具有三個甘露糖結(jié)合位點盒，通過對AEL的分析發(fā)現(xiàn)它比較特殊，AEL-subunitl有兩個甘露糖結(jié)合位點，一個已經(jīng)發(fā)生突變；AEL-subtmit2：只有一個甘露糖，其中有兩個已經(jīng)發(fā)生突變。二級和三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)他與GNA的結(jié)構(gòu)非常相似。密碼子的偏愛性分析發(fā)現(xiàn)AE