半夏凝集素基因的克隆及抗蟲小麥新種質(zhì)的創(chuàng)制.pdf

1、半夏凝集素蛋白具有只與甘露糖結(jié)合的特性，而人體以及哺乳類動物體內(nèi)的甘露糖很少，最新研究表明：半夏凝集素蛋白對刺吸式害蟲有良好的毒殺和抑制作用，因此，半夏凝集素基因可應(yīng)用于作物抗蟲育種。本研究通過RT-PCR方法克隆了半夏凝集素基因Pta，采用基因槍共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥，獲得了轉(zhuǎn)Pta基因的輪選987的T1代植株和科農(nóng)199的T0代植株。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以野生半夏為材料提取mRNA,根據(jù)NCBI公布的序列設(shè)計(jì)引物，通過R

2、T-PCR方法克隆了半夏凝集素基因，該基因編碼區(qū)長為807bp，編碼269個(gè)氨基酸，與NCBI上的序列完全吻合。
　　 2.構(gòu)建了高效表達(dá)載體pRTL2-Pta，并與含有抗除草劑篩選標(biāo)記的pHAC20(Bar基因)質(zhì)粒載體相混合，通過基因槍共轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化了輪選987成熟胚愈傷組織1049塊，獲得了T0代抗性再生植株99株，經(jīng)PCR檢測，含Pta基因、不含Bar基因的植株7株；含Bar基因、不含Pta基因的植株25株；兩個(gè)基因同時(shí)存

3、在的植株42株，目的基因Pta的轉(zhuǎn)化效率為4.6％左右。
　　 3.通過特異酶切目的基因表達(dá)盒片段的回收，采用Pta基因線性表達(dá)盒轉(zhuǎn)化小麥科農(nóng)199幼胚愈傷組織840塊，獲得167株抗性再生植株。PCR檢測獲得目的基因片段擴(kuò)增陽性植株26株。目的基因Pta的轉(zhuǎn)化效率為3.1％。
　　 4.初步調(diào)查結(jié)果顯示，輪選987轉(zhuǎn)基因陽性植株分蘗能力強(qiáng)，穗紡錘型，穗長7-10cm之間，多為9cm左右，農(nóng)藝性狀良好。T1代初步抗蟲鑒定