天南星凝集素和石蒜凝集素基因的克隆及抗蟲(chóng)研究.pdf

1、利用基因工程培育抗病蟲(chóng)作物是抗性育種重要的現(xiàn)代化手段.研究表明一些植物凝集素對(duì)多種害蟲(chóng)尤其是對(duì)同翅目類(lèi)害蟲(chóng)有較強(qiáng)的抗性.為了更多的對(duì)植物凝集素基因進(jìn)行研究,以天南星和石蒜為材料,利用RACE-PCR克隆技術(shù),成功克隆出了它們的凝集素基因.通過(guò)相關(guān)的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列與石蒜科、蘭科以及天南星科其它植物的凝集素基因有很高的同源性,為甘露糖特異結(jié)合的凝集素基因.為了研究天南星凝集素AHA的功能,構(gòu)

2、建了AHA的原核表達(dá)體系.將編碼天南星凝集素成熟蛋白的基因序列構(gòu)建到了原核表達(dá)載體pQE-30中,通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株,在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出了目的蛋白,并對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化.將純化的蛋白加入到人工飼養(yǎng)液中飼喂蚜蟲(chóng),發(fā)現(xiàn)純化的天南星凝集素蛋白有抗蟲(chóng)活性,能抑制蚜蟲(chóng)的生存和繁殖.為了研究天南星凝集素基因在利用基因工程技術(shù)培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物中的潛在應(yīng)用價(jià)值,構(gòu)建了含天南星凝集素基因(aha)的植物表達(dá)載體pBI121-AHA,利用

3、凍融法將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法,將aha轉(zhuǎn)入煙草中,在誘導(dǎo)生根移栽后對(duì)煙草植株進(jìn)行了一系列的分子檢測(cè).并對(duì)部分PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行了Southern blot和Northern blot雜交檢測(cè).Southern blot雜交結(jié)果顯示天南星凝集素基因已經(jīng)整合到了煙草的基因組中,Northern blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草成功表達(dá)了天南星凝集素基因.對(duì)表達(dá)AHA的轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(chóng)(蚜蟲(chóng))分析表明