中國水仙凝集素基因的克隆與表達(dá).pdf

1、農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在著嚴(yán)重危害。通過化學(xué)農(nóng)藥對(duì)害蟲進(jìn)行毒殺的效果雖然顯著,卻帶來了農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和生態(tài)平衡等問題。近年來，應(yīng)用基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行抗蟲植物育種研究，為控制農(nóng)業(yè)害蟲提供了新的思路。石蒜科植物凝集素具有很好的抗蟲效果,其中的雪花蓮凝集素基因已被應(yīng)用于抗蟲植物育種。中國水仙凝集素對(duì)一些刺吸式昆蟲有著很好的抑制作用，因此，克隆其凝集素基因，研究其抗蟲功能，可為進(jìn)一步開展抗蟲植物育種提供有價(jià)值的參考。
　　 本研

2、究從中國水仙‘金盞銀臺(tái)'中克隆出了一個(gè)凝集素基因，構(gòu)建了雙子葉植物表達(dá)載體，并成功將其轉(zhuǎn)化到煙草和擬南芥中，得到了轉(zhuǎn)基因植株；構(gòu)建了原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中高效表達(dá)了該凝集素蛋白。主要結(jié)果如下：
　　 1．利用RT-PCR技術(shù)從中國水仙(Narcissus tazetta var．Chinensis)‘金盞銀臺(tái)'中克隆到一個(gè)新的編碼凝集素的基因NTL1。序列分析與預(yù)測結(jié)果表明，該基因 cDNA片段總長為609 bp，含有一個(gè)由

3、25個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽和一個(gè)519 bp的完整開放閱讀框；編碼172個(gè)氨基酸，分子量為18.7 kD；前體蛋白在氨基酸水平上與雜種多花水仙凝集素、雪花蓮凝集素、石蒜凝集素的一致性分別為83％、81％和77％；結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋、不規(guī)則盤繞和延伸鏈為主；三級(jí)結(jié)構(gòu)與雪花蓮凝集素極其相似，是一種能與α-D-甘露糖特異性結(jié)合的凝集素。
　　 2．利用RT-PCR方法，以18S rRNA作為內(nèi)參基因，研究了NTL1基

4、因在中國水仙中的組織特異性表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)NTL1基因在根、鱗葉、葉片與花器官均有表達(dá)。
　　 3.采用直接添加酶切位點(diǎn)的方法，將NTL1基因構(gòu)建到雙元表達(dá)載體pBI121的多克隆位點(diǎn)，形成由35S啟動(dòng)的植物表達(dá)載體。分別采用葉盤法和蘸花法轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，獲得了抗性植株。經(jīng)PCR檢測，證明獲得了轉(zhuǎn)NTL1基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代植株進(jìn)行了分析，初步確定NTL1基因在煙草和擬南芥中得到表達(dá)。
　　 4．以pET-2