半夏凝集素基因的克隆及對(duì)菘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、通過對(duì)菘藍(lán)組織培養(yǎng)條件的選擇,找到了菘藍(lán)外植體(子葉和下胚軸)直接再生芽的最佳激素配比(MS<,0>+BA1mg/L+NAA0.2mg/L).配制一系列濃度的分別含G418(遺傳霉素)和Kan(卡那霉素)的菘藍(lán)外植體再生培養(yǎng)基,考察菘藍(lán)外植體的敏感濃度,結(jié)果表明菘藍(lán)外植體對(duì)G418比對(duì)KaN更敏感,20mg/L的G418是轉(zhuǎn)化菘藍(lán)合適的篩選濃度.以菘藍(lán)的子圳和下胚軸為外植體,采用葉盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行菘藍(lán)的遺傳轉(zhuǎn)化,并以未轉(zhuǎn)化的相同外植體同法操

2、作為陰性對(duì)照.經(jīng)過共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等步驟,獲得了菘藍(lán)的對(duì)G418的再生抗性植株,子葉再生頻率為15.3％,下胚軸再生頻率為23.1％.對(duì)獲得的再生抗性植株進(jìn)行分了生物學(xué)檢測(cè),PCR結(jié)果表明抗性植株在目的位置(805bp)處出現(xiàn)條帶,而未轉(zhuǎn)化菘藍(lán)在相應(yīng)位置出現(xiàn)條帶,初步表明pta基因已轉(zhuǎn)入菘藍(lán)基因組.抗性植的PCR陽性率為37.4％.選取四株P(guān)CR陽性株按SDS法提取總DNA進(jìn)行Southern雜交分析,分別采用EcoR I和S

3、ac I兩種限制性內(nèi)切酶酶切總DNA,結(jié)果表明1、4號(hào)樣品出現(xiàn)一個(gè)條帶,2、3號(hào)樣品出現(xiàn)兩個(gè)條帶,未轉(zhuǎn)化的菘藍(lán)未出現(xiàn)任何條帶.取上述四個(gè)樣品以TRIzol法提取總RNA,進(jìn)行Norther雜交分析,以未轉(zhuǎn)化的菘藍(lán)總RNA為陰性對(duì)照.結(jié)果四個(gè)樣品均出現(xiàn)雜交條帶,而阻性對(duì)照未出現(xiàn)雜交條帶.分子檢測(cè)的結(jié)果說明外源pta基因已經(jīng)整合進(jìn)行入菘藍(lán)基因組,1、4號(hào)樣品為一個(gè)拷貝,2、3號(hào)樣品為兩個(gè)拷貝,pta基因在菘藍(lán)中能正常表達(dá).將經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)基因

4、菘藍(lán)無菌苗從培養(yǎng)容器中取出,洗凈要命上附著的培養(yǎng)基后,室溫條件下培養(yǎng)在營養(yǎng)液(MS培養(yǎng)基大量元素稀釋50倍)中,半個(gè)月后即有較多的根生出.將完整的轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)苗移入移栽基質(zhì)(泥炭土,蛭石,珍珠巖等量混合)中,每天噴施營養(yǎng)液3次,并用保鮮袋罩住菘藍(lán)苗以保持濕度,兩周后菘藍(lán)苗即可移栽大田正常生長,移栽成活率達(dá)到100％.在裝有不含糖的MS培養(yǎng)基的容器中,以轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因菘藍(lán)的葉征作為受試材料,采用桃蚜(Myzus perisicae)作為受