豌豆早期結(jié)瘤素基因克隆與凝集素基因psl轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、結(jié)瘤固氮是豆科植物與根瘤菌專(zhuān)一性作用的結(jié)果。在根瘤菌的第一步入侵至根瘤形成的每一個(gè)過(guò)程中，都伴隨著宿主植物及根瘤菌特異性基因的表達(dá)。前人的研究已經(jīng)證明，植物凝集素在豆科植物識(shí)別根瘤菌的過(guò)程中起著不可缺少的重要作用，通過(guò)豆科植物間凝集素基因的轉(zhuǎn)化，可使一些豆科植物識(shí)別原本不能識(shí)別的根瘤菌。但是，人們?cè)诶萌松蠁?dòng)子將豆科植物凝集素基因轉(zhuǎn)化到非豆科植物時(shí)，并未能使非豆科轉(zhuǎn)基因植株識(shí)別相應(yīng)的根瘤菌。鑒于此，有必要在非豆科植物上模擬豆科植物凝集

2、素的原始表達(dá)機(jī)制，研究非豆科植物與根瘤菌的相互作用。 結(jié)瘤素基因(Nodulin Gene)是指特異地存在于根瘤菌感染產(chǎn)生的根瘤細(xì)胞中并參與共生固氮作用的植物基因，它們對(duì)于根瘤結(jié)構(gòu)的形成及維持、固氮活性的保護(hù)以及固氮產(chǎn)物的代謝等都有重要作用。根據(jù)表達(dá)時(shí)間的先后，它可分為早期結(jié)瘤素基因和晚期結(jié)瘤素基因。早期結(jié)瘤素基因在根瘤發(fā)育早期表達(dá)，參與“根瘤菌——根毛”相互作用及根瘤形態(tài)發(fā)生過(guò)程，對(duì)植物與根瘤菌之間的信息傳遞、根瘤菌的侵染及根

3、瘤的形成有著重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)關(guān)鍵的早期結(jié)瘤素基因，并在一定程度上闡述了它們的功能，不過(guò)它們的工作機(jī)理仍有待進(jìn)一步闡明。這些關(guān)鍵早期結(jié)瘤素基因在轉(zhuǎn)化到非豆科植物中后，是否能發(fā)揮相應(yīng)的功能，也需要進(jìn)一步的探索。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)從豌豆基因組DNA中克隆出豌豆凝集素基因(psl)及早期結(jié)瘤素基因PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40，構(gòu)建了psl基因的植物表達(dá)載體pVCT-PsL，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ps

4、l基因?qū)霟煵?。主要?shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.psl基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草 以豌豆(Pisum sativum L.)基因組DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得psl基因。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)1948 bp，包括編碼275個(gè)氨基酸的828 bp的開(kāi)放閱讀框、854bp的5’端控制區(qū)和266bp的3’端非翻譯區(qū)。與已報(bào)道的序列(GenBank登錄號(hào)X66368)相比較，核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序

5、列同源性分別為99.4％和100％。將psl基因插入到pVCT2020，構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體pVCT-PsL。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將psl基因?qū)霟煵?Nicotiana tobacum L.cv．Wisconsin38)中，共獲得10個(gè)獨(dú)立的卡那霉素抗性煙草株系，移栽后全部成活并開(kāi)花結(jié)果。PCR檢測(cè)初步確定psl基因已轉(zhuǎn)入煙草基因組中。 2.豌豆PsENOD12A基因的克隆 以豌豆基因組DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)特異

6、引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PsENOD12.4基因。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)1282 bp，含有編碼110個(gè)氨基酸的333 bp的開(kāi)放閱讀框和936 bp的5’端控制區(qū)。與GenBank公布的已知序列(X81366)相比，其核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列的同源率分別為99.9％(僅有1個(gè)堿基不同)和100％。 3.豌豆PsSYM10基因的克隆 以豌豆基因組DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PsSYM1

7、0基因。序列分析表明，該基岡全長(zhǎng)3310 bp，包括編碼594個(gè)氨基酸的1785 bp的開(kāi)放閱讀框、1000 bp的5’端控制區(qū)和525 bp的3’端非翻譯區(qū)。與GenBank公布的已知序列(AJ575250)相比，其核營(yíng)酸序列及推測(cè)的氨基酸序列的同源率分別為98.8％和100％。 4.豌豆PsENOD40基因的克隆 以豌豆基因組DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得PsENOD40基因。序列分析表明，該