皺紋盤鮑內(nèi)參基因篩選及C型凝集素基因表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、皺紋盤鮑是一種名貴的海洋經(jīng)濟(jì)貝類，伴隨其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，出現(xiàn)了病害頻發(fā)和種質(zhì)退化等問題，制約著產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。通過研究免疫相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律，探討皺紋盤鮑免疫機(jī)制，可為提高皺紋盤鮑抗病力提供理論參考。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)作為一種常用的分子生物學(xué)手段，可以快速、準(zhǔn)確和靈敏的檢測(cè)免疫相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律，從而了解其表達(dá)量的變化，進(jìn)而探討其功能。但是，基因表達(dá)量的分析需要穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校對(duì)，所以內(nèi)參基因的選擇決定著實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的

2、準(zhǔn)確性。
　　本研究選取了皺紋盤鮑β-肌動(dòng)蛋白(ACT)、18S核糖體RNA(18S)、細(xì)胞色素b(CYTB)、延伸因子1(EF1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核糖體蛋白S9（S9)和微管蛋白(TUB)等7個(gè)候選基因，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了各候選基因在皺紋盤鮑不同組織、不同發(fā)育時(shí)期以及受到藤黃微球菌和鰻弧菌刺激后血細(xì)胞樣品中的Ct值，利用Bestkeeper、Normfinder和Genorm等內(nèi)參篩選程序分析了各

3、基因表達(dá)的穩(wěn)定性；并以篩選出來的穩(wěn)定基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)了皺紋盤鮑C型凝集素分別在皺紋盤鮑各組織、各發(fā)育時(shí)期以及細(xì)菌刺激后血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律。
　　以內(nèi)參篩選程序分析了各候選基因在皺紋盤鮑鰓、外套膜、性腺、血細(xì)胞、肌肉和肝臟等不同組織樣品中的Ct值，通過Genorm和Normfinder分別分析M值和穩(wěn)定值發(fā)現(xiàn)各候選基因穩(wěn)定性由高到低為：ACT>CYTB>18S>TUB>EF1>GAP>S9；Bestkeeper分析標(biāo)準(zhǔn)差顯示各候

4、選基因穩(wěn)定性由高到低為：CYTB>18S>TUB>ACT>EF1>GAP>S9。綜合三種程序穩(wěn)定性排序可以得出：檢測(cè)某個(gè)基因在皺紋盤鮑不同組織樣品中的表達(dá)時(shí)，CYTB可作為內(nèi)參基因。
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)獲得皺紋盤鮑2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、16細(xì)胞、桑葚期、原腸期，擔(dān)輪幼蟲、面盤幼蟲、匍匐幼蟲和稚鮑等不同發(fā)育時(shí)期的各候選基因的Ct值，經(jīng)Genorm和Normfinder分析顯示各候選基因的穩(wěn)定性為ACT>CYTB>TUB

5、＞GAP>18S>EF1>S9；Bestkeeper分析顯示各候選基因穩(wěn)定性為TUB>ACT>GAP>18S>CYTB>S9>EF1。由三種程序綜合分析后得出：檢測(cè)某個(gè)基因在皺紋盤鮑不同發(fā)育時(shí)期樣品中的表達(dá)時(shí)，ACT可作為內(nèi)參基因。
　　以Genorm、Normfinder和Bestkeeper分析了各候選基因在皺紋盤鮑受到不同細(xì)菌刺激后血細(xì)胞樣品中的Ct值。①藤黃微球菌刺激后，Genorm和Normfinder分析得出各候選基因

6、穩(wěn)定性由高到低為 ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9；Bestkeeper分析得出各候選基因穩(wěn)定性由高到低為TUB>CYTB>ACT>EF1>18S>GAP>S9。②鰻弧菌刺激后Genorm分析得出各候選基因的穩(wěn)定性為 ACT>CYTB>TUB>EF1>18S>GAP>S9，Normfinder分析得出各候選基因的穩(wěn)定性為ACT>CYTB>TUB>EF1>GAP>18S>S9，Bestkeeper分析得出各候選基因的

7、穩(wěn)定性為ACT>TUB>CYTB>EF1>18S>S9>GAP。綜合三種程序的分析結(jié)果，在測(cè)定某個(gè)基因在鰻弧菌或藤黃微球菌后皺紋盤鮑血細(xì)胞樣品中表達(dá)量時(shí)，ACT可作為內(nèi)參基因。
　　利用篩選出來的ACT和CYTB作為內(nèi)參基因檢測(cè)了C型凝集素基因在皺紋盤鮑不同組織、發(fā)育時(shí)期以及受到藤黃微球菌和鰻弧菌刺激后血細(xì)胞樣品中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明：C型凝集素在不同組織中均有表達(dá)，在肌肉和血細(xì)胞中表達(dá)量最高；在桑葚期明顯上升，至匍匐幼蟲期達(dá)到最