合浦珠母貝C-型凝集素基因及其SNP位點研究.pdf

1、合浦珠母貝(Pincatadafucata)又稱馬氏珠母貝，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的低緯度海區(qū)，在我國主要分布于廣東、廣西和海南等沿海地區(qū)，是我國生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類之一，其生產(chǎn)的珍珠具有極高的經(jīng)濟價值。本研究在合浦珠母貝cDNA文庫構(gòu)建和測序的基礎上，經(jīng)過EST序列比對，獲得2個合浦珠母貝C-型凝集素(C-typelectin)基因，分別命名為PoLEC1和PoLEC2，分析了PoLEC1和PoLEC2的序列特征和組織表達

2、調(diào)控模式，對PoLEC1進行了原核重組表達及功能分析，證實了其具有凝集細菌的活性，同時，克隆了PoLEC1基因組，經(jīng)分析和篩選，獲得了30個SNP位點，分析其與露空脅迫抗性的相關性，證實了PoCL-S18和PoCL-S26位點與抗露空脅迫顯著相關，為合浦珠母貝分子標記輔助育種奠定了基礎。
　　 1.PoLEC1的序列、表達和功能分析
　　 PoLEC1全長998bp，5’-UTR為33bp，3’-UTR為101bp，開放

3、閱讀框為861bp，編碼287個氨基酸，分子量為31.68kDa，理論等電點約5.83。預測的氨基酸序列中含有信號肽(Met1-Ser19)和糖識別結(jié)構(gòu)域，糖識別結(jié)構(gòu)域中存在6個保守的半胱氨酸和1個糖結(jié)合位點。同源性分析結(jié)果表明，PoLEC1與其它物種C-型凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域序列同源性在16.9-27.3％之間，相似性在28.9-48.5％之間。進化分析結(jié)果表明，PoLEC1與櫛孔扇貝聚為一支，與無脊椎動物親緣較近。組織表達模式分析表

4、明PoLEC1mRNA在肝胰腺，外套膜、性腺、閉殼肌、腸、鰓和血淋巴組織均有表達，在肝胰腺中的表達量最高。經(jīng)溶藻弧菌刺激后，PoLEC1mRNA在肝胰腺中的表達分析結(jié)果表明，在刺激后2h表達顯著下調(diào)，而在4h和24h表達顯著上調(diào)。利用PoLEC1成熟肽序列構(gòu)建原核表達載體，在大腸桿菌中進行重組表達，用HisBind樹脂純化得到PoLEC1重組蛋白，細菌凝集實驗表明其對大腸桿菌和芽孢桿菌有明顯的凝集作用。
　　 2.PoLEC2的

5、序列分析和組織表達分析
　　 PoLEC2全長為1659bp，5’-UTR為39bp，3’-UTR為45bp，開放閱讀框為1575bp，可編碼525個氨基酸，分子量約58.03kDa，理論等電點為5.22。PoLEC2氨基酸含有信號肽序列(M1-A16)、一個MAM-2結(jié)構(gòu)域和一個C-型凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域。同源性分析結(jié)果表明，PoLEC2與其它物種C-型凝集素的糖識別結(jié)構(gòu)域序列的同源性在26.5-33.6％之間，相似性在45.

6、1-55.6％之間。進化分析結(jié)果表明，合浦珠母貝與貽貝在進化樹同一個分支上。組織表達模式分析表明PoLEC2mRNA在肝胰腺、外套膜、性腺、閉殼肌、腸和鰓組織均有表達，且在肝胰腺中的表達量最高。經(jīng)溶藻弧菌刺激后24h，PoLEC2mRNA在肝胰腺中的表達顯著上調(diào)；刺激后8h在腸中的表達量顯著上調(diào)。
　　 3.PoLEC1基因組的SNP分析
　　 在PoLEC1的cDNA序列中設計引物，進行基因組擴增，成功地獲得了基因組序

7、列，全長4943bp，包括4個外顯子和3個內(nèi)含子，3個內(nèi)含子的剪切位點都符合典型的GT/AG法則。同時，通過對基因組DNA的PCR產(chǎn)物直接測序，獲得30個SNP位點，其中13個是內(nèi)含子SNP，17個是外顯子SNP，有13個cSNP是錯義SNP引起氨基酸的變化。這些SNP位點的主要等位基因的頻率是0.55-1.00，次要的等位基因頻率0.00-0.45，經(jīng)基因型進行哈代-溫伯格平衡檢驗，16個SNP處于連鎖不平衡，進行等位基因頻率卡方檢驗