合浦珠母貝C-型凝集素基因及其SNP位點(diǎn)研究.pdf

1、合浦珠母貝(Pincatadafucata)又稱馬氏珠母貝，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋的低緯度海區(qū)，在我國(guó)主要分布于廣東、廣西和海南等沿海地區(qū)，是我國(guó)生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類之一，其生產(chǎn)的珍珠具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究在合浦珠母貝cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序的基礎(chǔ)上，經(jīng)過EST序列比對(duì)，獲得2個(gè)合浦珠母貝C-型凝集素(C-typelectin)基因，分別命名為PoLEC1和PoLEC2，分析了PoLEC1和PoLEC2的序列特征和組織表達(dá)

2、調(diào)控模式，對(duì)PoLEC1進(jìn)行了原核重組表達(dá)及功能分析，證實(shí)了其具有凝集細(xì)菌的活性，同時(shí)，克隆了PoLEC1基因組，經(jīng)分析和篩選，獲得了30個(gè)SNP位點(diǎn)，分析其與露空脅迫抗性的相關(guān)性，證實(shí)了PoCL-S18和PoCL-S26位點(diǎn)與抗露空脅迫顯著相關(guān)，為合浦珠母貝分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.PoLEC1的序列、表達(dá)和功能分析
　　 PoLEC1全長(zhǎng)998bp，5’-UTR為33bp，3’-UTR為101bp，開放

3、閱讀框?yàn)?61bp，編碼287個(gè)氨基酸，分子量為31.68kDa，理論等電點(diǎn)約5.83。預(yù)測(cè)的氨基酸序列中含有信號(hào)肽(Met1-Ser19)和糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域，糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域中存在6個(gè)保守的半胱氨酸和1個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)。同源性分析結(jié)果表明，PoLEC1與其它物種C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域序列同源性在16.9-27.3％之間，相似性在28.9-48.5％之間。進(jìn)化分析結(jié)果表明，PoLEC1與櫛孔扇貝聚為一支，與無(wú)脊椎動(dòng)物親緣較近。組織表達(dá)模式分析表

4、明PoLEC1mRNA在肝胰腺，外套膜、性腺、閉殼肌、腸、鰓和血淋巴組織均有表達(dá)，在肝胰腺中的表達(dá)量最高。經(jīng)溶藻弧菌刺激后，PoLEC1mRNA在肝胰腺中的表達(dá)分析結(jié)果表明，在刺激后2h表達(dá)顯著下調(diào)，而在4h和24h表達(dá)顯著上調(diào)。利用PoLEC1成熟肽序列構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，用HisBind樹脂純化得到PoLEC1重組蛋白，細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)大腸桿菌和芽孢桿菌有明顯的凝集作用。
　　 2.PoLEC2的

5、序列分析和組織表達(dá)分析
　　 PoLEC2全長(zhǎng)為1659bp，5’-UTR為39bp，3’-UTR為45bp，開放閱讀框?yàn)?575bp，可編碼525個(gè)氨基酸，分子量約58.03kDa，理論等電點(diǎn)為5.22。PoLEC2氨基酸含有信號(hào)肽序列(M1-A16)、一個(gè)MAM-2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域。同源性分析結(jié)果表明，PoLEC2與其它物種C-型凝集素的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域序列的同源性在26.5-33.6％之間，相似性在45.

6、1-55.6％之間。進(jìn)化分析結(jié)果表明，合浦珠母貝與貽貝在進(jìn)化樹同一個(gè)分支上。組織表達(dá)模式分析表明PoLEC2mRNA在肝胰腺、外套膜、性腺、閉殼肌、腸和鰓組織均有表達(dá)，且在肝胰腺中的表達(dá)量最高。經(jīng)溶藻弧菌刺激后24h，PoLEC2mRNA在肝胰腺中的表達(dá)顯著上調(diào)；刺激后8h在腸中的表達(dá)量顯著上調(diào)。
　　 3.PoLEC1基因組的SNP分析
　　 在PoLEC1的cDNA序列中設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行基因組擴(kuò)增，成功地獲得了基因組序

7、列，全長(zhǎng)4943bp，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)都符合典型的GT/AG法則。同時(shí)，通過對(duì)基因組DNA的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，獲得30個(gè)SNP位點(diǎn)，其中13個(gè)是內(nèi)含子SNP，17個(gè)是外顯子SNP，有13個(gè)cSNP是錯(cuò)義SNP引起氨基酸的變化。這些SNP位點(diǎn)的主要等位基因的頻率是0.55-1.00，次要的等位基因頻率0.00-0.45，經(jīng)基因型進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)，16個(gè)SNP處于連鎖不平衡，進(jìn)行等位基因頻率卡方檢驗(yàn)