棉鈴蟲兩種C-型凝集素HaCTL3和HaCTL7的功能研究.pdf

1、與脊椎動物相比，無脊椎動物的免疫系統(tǒng)相對更為簡單，缺少傳統(tǒng)意義上的獲得性免疫系統(tǒng)。免疫反應的開啟是通過模式識別受體(patternrecognitionreceptors，PRRs)識別病原物的病原相關分子(pathogen-associatedmoleculepatterns，PAMPs)，啟動免疫反應。無脊椎動物中有許多模式識別受體，其中C-型凝集素就屬于一大類蛋白家族。本研究組在前期工作中通過對棉鈴蟲免疫刺激后的脂肪體組織進行轉錄

2、組測序，找到了六種C型凝集素序列。我們挑選其中的兩個基因HaCTL3和HaCTL7來進行研究。我們對HaCTL3和HaCTL7，及HaCTL7N端CRD（HaCTL7D1）和C端CRD(HaCTL7D2)進行了原核表達、純化。獲得重組蛋白后，我們對蛋白的體外（細菌凝集，包囊）和體內(nèi)（黑化）活性進行了一系列的研究分析。具體結果如下:
　　1.棉鈴蟲C-型凝集素HaCTL3原核表達、純化與功能研究
　　我們從棉鈴蟲脂肪體中克隆得

3、到一種新型的C-型凝集素HaCTL3。HaCTL3、表達載體pET-32a(+)同時用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，連接、轉化、篩選、測序驗證后成功得到陽性克隆。并在IPTG的誘導下成功表達出重組蛋白rHaCTL3，將細胞破碎后取沉淀經(jīng)變性復性后，過Ni純化柱得到可溶且具有生物活性的重組蛋白。其大小在50kDa左右。
　　將重組蛋白進行了凝集、包囊和黑化等試驗。結果發(fā)現(xiàn)重組蛋白rHaCTL3對實驗中的三種革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄

4、球菌、微桿菌、生淀粉糖化酶菌）和四種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、反消化細菌、放射型根瘤菌、弧菌）均具有凝集活性，并且活性依賴于Ca2+的存在。其中rHaCTL3對大腸桿菌的凝集活性最為明顯。rHaCTL3的凝集活性對Ca2+的最小依賴濃度相差不大。體外糖抑制實驗還發(fā)現(xiàn)rHaCTL3主要受到Mal、LPS、PGN抑制。推測其對Mal等相關糖的一類病原物能進行特異性地識別。蛋白體外和凝膠珠孵育后，可促進血細胞對凝膠珠的包被。同時還發(fā)現(xiàn)，重組蛋白

5、與凝膠珠孵育后可以促進對凝膠珠的黑化作用，暗示rHaCTL3在激活酚氧化酶級聯(lián)反應過程起作用。
　　2.棉鈴蟲C-型凝集素HaCTL7及其糖識別結構域HaCTL7D1、HaCTL7D2原核表達、純化與功能研究
　　同上述HaCTL3類似，首先通過基因克隆分別得到HaCTL7成熟肽序列和單結構域HaCTL7D1、HaCTL7D2基因。用EcoRⅠ和XhoⅠ對三部分基因片段和表達載體pET-32a同時雙酶切，同樣構建好三種重組表

6、達質(zhì)粒并分別轉化表達菌株，IPTG誘導得到重組蛋白rHaCTL7、rHaCTL7D1、rHaCTL7D2，其分子量分別為46kDa、28kDa、30kDa。功能研究發(fā)現(xiàn)，rHaCTL7和rHaCTL7D2在Ca2+存在下，能對實驗中三種革蘭氏陽性菌和四種陰性菌產(chǎn)生凝集，且它們的凝集能力相比較rHaCTL3更為顯著，對各種細菌的最小凝集濃度更低。且rHaCTL7和rHaCTL7D2對各種細菌的凝集能力相當，無明顯差異。它們對Ca2+的依賴

7、程度和rHaCTL3相近。
　　除凝集作用外，rHaCTL7和rHaCTL7D2還可以參與細胞反應如包囊，通過實驗組中重組蛋白和凝膠珠孵育后，能明顯增強血細胞對凝膠珠的包被作用。同時rHaCTL7和rHaCTL7D2也增強了對凝膠珠的黑化作用，暗示它們參與了酚氧化酶的激活。N端的糖識別結構域rHaCTL7D1的功能分析表明，rHaCTL7D1既不參與對細菌的凝集，也沒有促進血細胞對凝膠珠的包被和黑化，暗示它可能在其它的免疫過程中發(fā)