寄生蜂對(duì)棉鈴蟲(chóng)凝集素和溶血素的調(diào)控及寄主新免疫因子的鑒定.pdf

1、本文以我國(guó)重要農(nóng)作物害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera與其優(yōu)勢(shì)種幼蟲(chóng)內(nèi)寄生蜂棉鈴蟲(chóng)齒唇姬蜂Campoletis chlorideae為寄生體系，研究了寄生蜂C.chlorideae寄生對(duì)寄主H. armigera血淋巴免疫識(shí)別因子C-型凝集素和溶血素的調(diào)控和誘導(dǎo)。并對(duì)寄主棉鈴蟲(chóng)唾液（反吐液）中新發(fā)現(xiàn)的免疫相關(guān)物質(zhì)凝集素和溶血素進(jìn)行了識(shí)別和初步鑒定。進(jìn)一步，對(duì)分別來(lái)自棉鈴蟲(chóng)血淋巴和唾液中的溶血素進(jìn)行了理論特性的研究，以期為

2、深入研究其分子結(jié)構(gòu)和生理功能提供依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　一、棉鈴蟲(chóng)齒唇姬蜂寄生對(duì)棉鈴蟲(chóng)凝集活性和C-型免疫凝集素基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
　　為探明內(nèi)寄生蜂成功調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。本文通過(guò)棉鈴蟲(chóng)齒唇姬蜂和寄主棉鈴蟲(chóng)這一寄生體系，研究寄生對(duì)寄主幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、血淋巴蛋白和凝集活性，以及8個(gè)C-型凝集素基因轉(zhuǎn)錄水平等的影響。結(jié)果表明：寄生顯著抑制棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致血淋巴蛋白含量顯著提高，出現(xiàn)多條寄生特異蛋白。凝集素作為重要

3、的體液免疫因子，在棉鈴蟲(chóng)發(fā)育的不同時(shí)期均有表達(dá)，且隨蟲(chóng)齡增大活性增強(qiáng)。寄生蜂寄生后第2 d和6 d，被寄生幼蟲(chóng)血淋巴凝集素活性分別是未被寄生幼蟲(chóng)的4和8倍。在棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育期，8個(gè)C-型凝集素的表達(dá)特性存在明顯差異，從末齡幼蟲(chóng)的取食期到游走期，凝集素基因 HaCTL1、HaCTL3、HaCTL4和HaCTL5的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而HaCTL2和HaCTL7卻出現(xiàn)下調(diào)。該結(jié)果表明這些凝集素基因的轉(zhuǎn)錄水平與昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)即受激素

4、的調(diào)控。組織特異性研究表明，8個(gè)C-型凝集素主要在血細(xì)胞和脂肪體中表達(dá)，此外，在中腸、表皮、馬氏管、精巢和唾腺中也有表達(dá)，但不同基因在不同組織中的表達(dá)特性存在顯著差異。寄生蜂寄生對(duì)這些凝集素基因的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控明顯不同，在寄生后第4 d，8個(gè)凝集素中除HaCTL6外均被顯著抑制，這表明 C-型凝集素參與了寄主昆蟲(chóng)和寄生蜂間的免疫與免疫抑制作用。本研究提供了寄生蜂寄生對(duì)寄主免疫凝集素調(diào)控的信息，可以增強(qiáng)目前我們對(duì)于寄生蜂成功寄生的認(rèn)識(shí)，為

5、更好的利用寄生蜂防治棉鈴蟲(chóng)奠定基礎(chǔ)。
　　二、棉鈴蟲(chóng)齒唇姬蜂寄生誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)血淋巴溶血因子的高表達(dá)
　　溶血素或溶血因子（Hemolysin，hemolytic factor）在無(wú)脊椎動(dòng)物中普遍存在，因其具有溶解異物的特性而備受關(guān)注，是重要的體液免疫因子。無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)入侵病原物的溶解是其先天免疫的一種主要形式，但目前對(duì)植食性昆蟲(chóng)中是否存在溶血因子尚無(wú)詳細(xì)報(bào)道。為此，本文綜合運(yùn)用了4種溶血檢測(cè)法即V底微量反應(yīng)板、顯微鏡觀察、瓊脂

6、糖平板溶血斑和分光光度法分別測(cè)試了多食性昆蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)血淋巴對(duì)脊椎動(dòng)物雞、鴨和兔血紅細(xì)胞的溶血活性，以充足的的證據(jù)表明在棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)血淋巴中存在有溶血活性物質(zhì)。進(jìn)一步，通過(guò)硫酸銨鹽析、透析初步分離出具有溶血活性的物質(zhì)，表明其為蛋白質(zhì)。此外，除幼蟲(chóng)期，在棉鈴蟲(chóng)卵、蛹和成蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)有溶血素。幼蟲(chóng)蟲(chóng)齡不同表現(xiàn)出明顯的溶血活性差異，且幼蟲(chóng)取食期溶血活性明顯高于蛻皮期或蛻皮初期。溶血素在棉鈴蟲(chóng)的多個(gè)組織中均有分布，如唾腺、脂肪體、表皮、中腸和精巢，

7、而唾腺和脂肪體的溶血活性最高。棉鈴蟲(chóng)齒唇姬蜂寄生后第2 d，被寄生棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)血淋巴溶血活性比未被寄生幼蟲(chóng)的活性提高了3.4倍。該結(jié)果表明棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)血淋巴中存在的溶血活性物質(zhì)能夠被寄生蜂寄生所誘導(dǎo)。注射大腸桿菌12和24 h后，棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)血淋巴溶血活性顯著提高。由此推斷，該溶血因子是可誘導(dǎo)的或是從頭合成的，這意味著該溶血因子與寄主昆蟲(chóng)的免疫反應(yīng)相關(guān)，可能通過(guò)抑制或清除入侵的病原物或寄生物來(lái)實(shí)施免疫防御。
　　三、棉鈴蟲(chóng)唾液（反吐液）

8、中新凝集素和溶血素的識(shí)別與初步鑒定
　　凝集素作為模式識(shí)別受體，在異物識(shí)別中發(fā)揮重要作用。棉鈴蟲(chóng)血淋巴中含有至少8種凝集素，但對(duì)其唾液（口腔反吐物）是否存在識(shí)別異物的凝集素卻從未涉及。本文通過(guò)V底微量反應(yīng)板檢測(cè)到棉鈴蟲(chóng)唾液含有凝集活性物質(zhì)。在相差顯微鏡下，可觀察到唾液使雞血紅細(xì)胞發(fā)生明顯的凝集現(xiàn)象。經(jīng)硫酸銨鹽析，35％和45%硫酸銨沉淀出的蛋白具有明顯的凝集活性，表明其為蛋白質(zhì)。通過(guò)糖抑制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)唾液凝集素與血淋巴凝集素的

9、糖結(jié)合譜存在差異，表明他們是不同的凝集素種類(lèi)。此外，利用不同脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞通過(guò) V底微量反應(yīng)板、顯微鏡觀測(cè)、瓊脂糖平板溶血斑和分光光度法4種溶血活性檢測(cè)方法，證實(shí)了棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)唾液中存在溶血活性物質(zhì)，它的溶血活性遠(yuǎn)高于同體積血淋巴的活性。低齡幼蟲(chóng)溶血活性略高于高齡幼蟲(chóng)。且在供試的亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、二點(diǎn)委夜蛾P(guān)roxenus lepigone、菜青蟲(chóng)Pieris r

10、apae等鱗翅目昆蟲(chóng)中普遍存在。但是，溶血活性存在差異。如二點(diǎn)委夜蛾溶血活性最高，棉鈴蟲(chóng)次之，玉米螟、甜菜夜蛾和菜青蟲(chóng)唾液溶血活性相對(duì)最低。取食的食物對(duì)棉鈴蟲(chóng)唾液溶血活性也產(chǎn)生影響，如取食人工飼料飼養(yǎng)的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)唾液溶血活性最高，辣椒次之，甘藍(lán)最低。進(jìn)一步，對(duì)唾液溶血素的發(fā)生來(lái)源進(jìn)行了分析，中腸液溶血活性最高，唾液和前腸液溶血活性次之，而后腸液溶血活性最低；對(duì)相應(yīng)組織研磨液溶血活性分析發(fā)現(xiàn)，唾腺研磨液溶血活性最高，前腸和中腸次之，后腸組

11、織研磨液只有極低的溶血活性，由此判斷唾腺和中腸是其可能的來(lái)源。唾液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析后，同樣獲得了具有溶血活性的物質(zhì)，表明其為蛋白質(zhì)。利用不同脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞進(jìn)行交叉吸附試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它對(duì)不同紅細(xì)胞種類(lèi)的溶血活性以兔紅細(xì)胞最強(qiáng)，且紅細(xì)胞吸附后的唾液溶血活性被明顯抑制。進(jìn)一步，用制備的紅細(xì)胞膜吸附處理唾液樣品，通過(guò) SDS-PAGE電泳，篩選具有與膜結(jié)合并具有溶血活性的蛋白，共獲得分子量48 kDa、28 kDa和23 kDa的差異蛋白條帶。利

12、用ESI質(zhì)譜鑒定，從中篩選出革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白和肽聚糖識(shí)別蛋白，其分子量分別為42.0 kDa和20.1kDa，等電點(diǎn)pI分別為5.85和5.71。除此之外，還有一些酶類(lèi)。由此推斷棉鈴蟲(chóng)唾液中的溶血素可能與識(shí)別和溶解病原細(xì)菌有關(guān)。
　　四、棉鈴蟲(chóng)血淋巴溶血素的理化特性
　　為深入研究棉鈴蟲(chóng)血淋巴新發(fā)現(xiàn)的免疫因子溶血素的分子結(jié)構(gòu)和生理功能，明確其分離、純化的理化條件非常重要。本文分別就溫度、pH、EDTA和金屬離子對(duì)該溶血素

13、的影響及其糖結(jié)合特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：棉鈴蟲(chóng)血淋巴溶血素?zé)岱€(wěn)定性較差，在50℃時(shí)，溶血活性顯著下降，60℃時(shí)，溶血活性即完全喪失，屬熱不穩(wěn)定型。血淋巴溶血素反應(yīng)濃度與溶血活性并不成正比，8倍稀釋液的溶血活性反高于4倍稀釋液，但隨稀釋倍數(shù)增加，32倍及以上稀釋倍數(shù)的血淋巴無(wú)溶血活性。血淋巴與紅細(xì)胞在反應(yīng)前60 min內(nèi)，溶血百分率無(wú)明顯變化，反應(yīng)2 h后，對(duì)紅細(xì)胞溶解速度急劇加快，6 h溶血效能最大。血淋巴溶血活性的最適pH為7-8。

14、濃度62.5、125、250和500 mM EDTA對(duì)血淋巴溶血活性具有促進(jìn)作用，而金屬離子Mn2+、Zn2+、Co2+和Ca2+卻具有極顯著的抑制作用。糖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明：D-乳果糖、棉子糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷（PNPG）和唾液酸均未對(duì)血淋巴溶血活性產(chǎn)生抑制作用，說(shuō)明棉鈴蟲(chóng)血淋巴溶血素與上述糖沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)。
　　五、棉鈴蟲(chóng)唾液（反吐液）溶血素的理化特性
　　探明棉鈴蟲(chóng)唾液

15、（反吐液）中溶血素的理化特性，可為深入研究棉鈴蟲(chóng)的免疫防御機(jī)制提供依據(jù)。采用雞血紅細(xì)胞對(duì)棉鈴蟲(chóng)唾液進(jìn)行溶血活性測(cè)定，研究溫度、濃度、作用時(shí)間、pH、EDTA和金屬離子等理化因子對(duì)其溶血活性的影響，通過(guò)糖抑制試驗(yàn)分析其結(jié)合特性，并以蜜蜂蜂毒溶血肽的特性進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明：在45℃、50℃條件下，棉鈴蟲(chóng)唾液溶血素的溶血活性升高，在60℃-100℃活性降低，但溶血活性依然可達(dá)最大溶血活性的67.5%，說(shuō)明其具有一定的熱穩(wěn)定性。與之相比，蜂

16、毒溶血肽熱穩(wěn)定性極強(qiáng)，在100℃下，溶血活性保持不變。唾液樣品在稀釋16倍時(shí)溶血活性達(dá)最高，是未經(jīng)稀釋原液溶血活性的1.6倍，而蜂毒樣品在稀釋1-32倍之間，溶血活性變化不明顯。唾液溶血素與紅細(xì)胞在反應(yīng)5-15 min之間，對(duì)紅細(xì)胞溶解速率最大。蜂毒樣品在35 min-1 h和2-6 h出現(xiàn)兩次紅細(xì)胞快速溶解。唾液溶血素具有廣泛的pH耐受度，在pH2-10，溶血活性沒(méi)有變化。唾液經(jīng)125、250和500 mM EDTA處理后，溶血活性顯

17、著升高，而蜂毒只在500 mM EDTA下溶血活性顯著提高，62.5、125、250和1000 mM EDTA下溶血活性反被顯著抑制。金屬離子Mn2+、Zn2+、Co2+、Ca2+和 Ni2+抑制唾液溶血素活性，而 K+和 Mg2+對(duì)唾液溶血素活性具有促進(jìn)作用。對(duì)于蜂毒，Mn2+、Zn2+、Co2+和Ni2+能夠顯著抑制其溶血活性。糖抑制試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)試的D-乳果糖、PNPG、棉籽糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖和唾液酸對(duì)唾液