家蠶C-型凝集素11(BmCTL11)的表達(dá)特征及功能初探.pdf

1、昆蟲是地球生態(tài)系統(tǒng)中一類具有重要地位的生物，已經(jīng)報(bào)道的大約有100多萬(wàn)種。作為無(wú)脊椎動(dòng)物，昆蟲缺少高等動(dòng)物的適應(yīng)性免疫，然而經(jīng)過長(zhǎng)期的自然進(jìn)化，它們已然形成了一套高效快速的防御體系用于防御外界微生物或病原生物的侵染。在微生物表面存在保守度較高的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，無(wú)脊椎動(dòng)物利用體內(nèi)含有的模式識(shí)別受體(PRRS)能夠識(shí)別病原生物的PAMPs，從而辨別病原啟動(dòng)進(jìn)一步的免疫。
　　家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時(shí)也是重要的鱗翅目模

2、式昆蟲，與大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，其體內(nèi)有多種免疫識(shí)別分子/受體，其中一類稱為C-型凝集素。本論文利用家蠶為實(shí)驗(yàn)材料，研究家蠶體內(nèi)的一類C-型凝集素。通過本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作，即家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）誘導(dǎo)家蠶全基因組轉(zhuǎn)錄應(yīng)答分析顯示，家蠶C-型凝集素11基因（BmCTL11）在感染中后期持續(xù)高量表達(dá)，因此，本論文選擇BmC TL11基因，對(duì)其進(jìn)行克隆表達(dá)和制備抗體，并對(duì)其轉(zhuǎn)錄特征及功能進(jìn)行分析，主要研究結(jié)果如下:

3、
　　1.BmCTL11的生物信息學(xué)分析
　　對(duì)BmCTL11基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于第10號(hào)染色體上;BmCTL11編碼一個(gè)含有307個(gè)氨基酸的多肽，蛋白預(yù)測(cè)分子量34.51KDa，等電點(diǎn)是4.69，包含兩個(gè)串聯(lián)的典型的C-型凝集素糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)，分別是CRD1（47--148位氨基酸）和CRD2（184--303位氨基酸），編碼蛋白的開放閱讀框大小為924bp，無(wú)內(nèi)含子。1--22位氨基酸為信號(hào)肽，含有兩個(gè)潛

4、在的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于N214和N253氨基酸，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示BmCTL11含有4個(gè)α螺旋和18個(gè)β折疊，且其C端有甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，暗示BmCTL11具有糖結(jié)合能力。分析正常家蠶的芯片數(shù)據(jù)，BmCTL11(BGIBMGA006623，sw21899)在脂肪體、表皮、卵巢、精巢、頭等組織中轉(zhuǎn)錄，卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平高于精巢，其中脂肪體的轉(zhuǎn)錄水平最高，暗示該基因可能在免疫防御中發(fā)揮一定的作用。并且經(jīng)N.bombycis誘導(dǎo)后，Bm

5、CTL11明顯上調(diào)表達(dá)。
　　2.BmCTL11基因表達(dá)譜分析
　　對(duì)家蠶不同組織進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示:BmCTL11主要在脂肪體、馬氏管和生殖腺中轉(zhuǎn)錄，在絲腺和氣管中的轉(zhuǎn)錄水平較低，但在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平較高;BmCTL11在家蠶的整個(gè)幼蟲時(shí)期幾乎都有轉(zhuǎn)錄，在蛹的后期沒有轉(zhuǎn)錄，這暗示BmCTL11在家蠶的幼蟲時(shí)期具有重要作用;此外，黑胸?cái)⊙挎邨U菌(Bb)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、

6、畢赤酵母（Gs115）、球孢白僵菌（Bba）、家蠶微孢子蟲(N.bombycis)、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)6種微生物誘導(dǎo)BmCTL11的qRT-PCR分析結(jié)果表明該基因能夠被不同病原誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且在24h內(nèi)BmCTL11的變化明顯，推測(cè)該基因在在病原侵染家蠶初期可能扮演著重要的角色。
　　3.Bm CTL11的克隆表達(dá)及其抗體制備
　　利用BmCTL11的序列，設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽序列的克隆引物，擴(kuò)增片段酶切后插入表達(dá)

7、載體pET32，構(gòu)建pET32-BmCTL11融合表達(dá)載體，驗(yàn)證正確后，導(dǎo)入Rosetta表達(dá)菌株，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示該重組蛋白以可溶蛋白和包涵體蛋白兩種形式表達(dá)。以純化后的rBmCTL11免疫昆明鼠制備rBmCTL11鼠源的多克隆抗體，ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)超過1∶102400。使用rBmCTL11多克隆抗體與家蠶的組織蛋白進(jìn)行Western blotting分析，發(fā)現(xiàn)在60KDa位置附近有雜交信號(hào)

8、，與預(yù)測(cè)大小34.51KDa大小不一致，推測(cè)有如下可能:存在翻譯后修飾;自身形成二聚體;與家蠶體內(nèi)的其它凝集素形成異二聚體或與家蠶體內(nèi)其他蛋白形成復(fù)合體。
　　4.BmCTL11的功能初探
　　純化rBmCTL11獲取可溶蛋白后，進(jìn)行rBmCTL11的結(jié)合試驗(yàn)。糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rBmCTL11具有甘露糖、脂多糖(LPS)和半乳糖(Gal)的結(jié)合活性，并且rBmCTL11與LPS的結(jié)合具有鈣離子依賴性，說明rBmCTL11與

9、大腸桿菌的結(jié)合具有鈣離子依賴性;黑胸?cái)⊙挎邨U菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、畢赤酵母和的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rBmCTL11能夠明顯結(jié)合這四種微生物，并且rBmCTL11能夠凝集黑胸?cái)⊙挎邨U菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和畢赤酵母，推測(cè)rBmCTL11可能是通過識(shí)別病原表面的某些成分觸發(fā)家蠶的先天免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步研究BmCTL11蛋白是否參與家蠶先天免疫，本文對(duì)家蠶血細(xì)胞的包被實(shí)驗(yàn)和血漿的黑化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rBmCTL11能夠促進(jìn)家蠶血細(xì)胞的包被與