石斑魚(yú)C型凝集素和兩個(gè)凋亡相關(guān)基因的克隆與功能研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文石斑魚(yú)C型凝集素和兩個(gè)凋亡相關(guān)基因的克隆與功能研究姓名：魏京廣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：海洋生物學(xué)指導(dǎo)教師：秦啟偉20100602石斑魚(yú)C型凝集素和兩個(gè)凋宦相關(guān)基因的克隆與功能研究作用；從胰酶水解實(shí)驗(yàn)中可以看出鈣離子在胰酶水解rEcCTL過(guò)程中起到一定的保護(hù)作用。2、采用RACE技術(shù)克隆得到石斑魚(yú)硫氧還蛋白基因全長(zhǎng)eDNA，將其命名為EcTrx(767bp)。ORF預(yù)測(cè)和氨基酸序列分析表明，該蛋白是一個(gè)典型的硫氧還蛋白

2、。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)EcTrx的全長(zhǎng)與熱帶爪蟾對(duì)應(yīng)的序列有61％的同源性。EcTrx主要在一些免疫器官中表達(dá)，皮膚中表達(dá)量最高。用釀酒酵母菌、創(chuàng)傷弧菌、金黃色葡萄球菌以及SGIV刺激石斑魚(yú)時(shí)其肝臟中的EcTrx表達(dá)量會(huì)不同程度的升高，而GS細(xì)胞在受到不同的溫度和H202刺激時(shí)其細(xì)胞中EcTrx的表達(dá)量也具有不同程度的上升o構(gòu)建EcTrx基因的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白，并獲得鼠源的多克隆抗體brEcTrx蛋白具有明顯的抗氧化活性的能力，

3、其抗氧化活性為4：lTU／‘mg蛋白‘，明顯高于GSH(150U／mg蛋白)。DNAnicking實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了rEcTrx蛋白的抗氧化活性。亞細(xì)胞定位觀察結(jié)果表明，pEGFPEcTrx轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞和GP細(xì)胞后所表達(dá)的EcTrxEGFP在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中存在。成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNATrx，并對(duì)其穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行了篩選。抗凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EcTrx對(duì)放線菌酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。3、通過(guò)RACE技術(shù)首次克隆得到了石斑

4、魚(yú)TCTP基因的eDNA全長(zhǎng)，命名為EcTCrP(1047bp)。ORF預(yù)測(cè)和氨基酸序列分析表明，該蛋白編碼170個(gè)氨基酸，具有典型的TCTP蛋白家族的特征序列。EcTCTP主要在肝臟中表達(dá)。當(dāng)石斑魚(yú)受到SGIV刺激時(shí)肝臟中的EcTCTP表達(dá)量會(huì)不同程度的下降。成功構(gòu)建EcTCTP原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白，并獲得多克隆抗體。rEcTCTP具有一定的抗氧化活性。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，pEGFPEcTa曙轉(zhuǎn)染FHM細(xì)胞和GP細(xì)胞后