石斑魚(yú)抗菌肽Hepcidin基因的克隆、表達(dá)與抗菌活性研究.pdf

1、本研究根據(jù)鱸魚(yú)抗菌肽Hepcidin基因(GenBank登錄號(hào)AY5472821)的cDNA序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物，利用RT-PCR技術(shù)從石斑魚(yú)肝臟中擴(kuò)增到一條基因片段，并采用RACE技術(shù)，獲得了該基因的全長(zhǎng)592bp的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：DQ177321)。該基因含有一個(gè)261bp堿基的閱讀框(ORF)，可編碼87個(gè)氨基酸的多肽，包括24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、40個(gè)氨基酸的優(yōu)勢(shì)域和23個(gè)氨基酸的成熟肽(內(nèi)含4個(gè)半胱氨酸)；

2、預(yù)測(cè)成熟肽分子量約為2465.8Da，等電點(diǎn)PI為5.97，是一種陰離子肽。BLAST檢索表明，該多肽與其他肽類的同源性較低，但與多種魚(yú)類來(lái)源的Hepcidin抗菌肽的同源性較高，推測(cè)是魚(yú)類Hepcidin抗菌肽家族的一個(gè)新成員。 運(yùn)用PCR和反向PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得其基因組DNA序列，與已知Hepcidin基因的結(jié)構(gòu)組成相同，均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。第一個(gè)外顯子包含5′ UTR、信號(hào)肽和部分優(yōu)勢(shì)域編碼序列，第二個(gè)外顯子僅

3、編碼部分優(yōu)勢(shì)域，而第三個(gè)外顯子編碼部分的優(yōu)勢(shì)域和成熟肽序列以及3′ UTR。分析基因組DNA上游區(qū)域，發(fā)現(xiàn)含有多個(gè)調(diào)控序列，包括TATA框和cap帽子結(jié)構(gòu)，確認(rèn)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與擴(kuò)增得到的Hepcidin cDNA的5′端起始序列一致；另外還發(fā)現(xiàn)了上游調(diào)控區(qū)內(nèi)多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。 將不含信號(hào)肽的該基因cDNA編碼序列與融合表達(dá)載體pTrc-CKS連接，轉(zhuǎn)化入E.coli TOP10F′表達(dá)菌株，IPTG誘導(dǎo)后得到的表達(dá)產(chǎn)物主要

4、以包涵體為主，上清中的部分可溶性蛋白經(jīng)過(guò)金屬鏊合層析純化后，得到較高純度的融合蛋白，經(jīng)重組人鼻病毒14亞型P3C蛋白酶酶切，獲得了分子量約為14 kDa的融合表達(dá)目的蛋白的酶切產(chǎn)物。 研究了融合表達(dá)蛋白酶切產(chǎn)物對(duì)4種細(xì)菌的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠選擇性抑制部分革蘭氏陽(yáng)性菌(如金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌)和革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌)的生長(zhǎng)，但對(duì)表皮葡萄球菌無(wú)抗菌活性：65℃水浴60 min后仍對(duì)溶壁微球菌具有抗菌活性，表明該蛋白具