抗菌肽快速篩選方法與抗菌活性的研究.pdf

1、本文利用抗菌肽與微生物作用前期與細菌膜吸附結合過程，研究一種能實現(xiàn)抗菌肽快速篩選并確定其一級結構的方法。通過對比與大腸桿菌孵育前后UPLC圖譜的變化，從中選擇出消失的峰組分即為可能的抗菌肽組分，并對孵育前和孵育后的各峰組分抑菌活性分別進行測定，以驗證抗菌肽的篩選結果。選取兩種不同來源的原料進行驗證。
　　 將家蠅蠅蛆蛋白粗提液和乳酸菌LP6固態(tài)發(fā)酵大豆蛋白提取液分別通過UPLC，分別對比與大腸桿菌孵育前后的圖譜變化，快速篩選圖譜

2、中消失的峰組分，分別命名為HLP7、HLP8、FSP6、FSP8、FSP9。通過RP-HPLC對兩種原料孵育前后的各峰組分別進行收集并測定抗菌活性，實驗結果表明，具有較強抗菌活性的只有消失的組分HLP7、HLP8、FSP6、FSP8、FSP9，其他未消失掉的組分均無抗菌活性。證明通過此方法能夠實現(xiàn)抗菌肽的快速篩選，可以大大減少抗菌肽發(fā)現(xiàn)的實驗周期。
　　 對HLP7、HLP8、FSP6、FSP8、FSP9對不同致病菌的抗菌活性進

3、行檢測，結果表明這幾個組分對大腸桿菌ATCC25922、鼠傷寒沙門氏菌50013、綠膿桿菌、枯草桿菌9372與金黃色葡萄球菌6538等致病菌均具有較強的抗菌活性，其中FSP8和FSP9對工程菌E.coli JM109工程菌也有抗菌活性。
　　 分別檢測五種抗菌肽的抗菌活性，表明隨著抗菌肽疏水性的增強，抗菌活性也增強。經(jīng)MAFSPI-TOF/TOF-MS質譜鑒定其氨基酸序列分別為：KPPLNGPAL、QPVYHWYWH、VVTSS

4、SLP、RMRLLLRRKGGQ和RVLLLPAFAEK，經(jīng)在線三大數(shù)據(jù)庫搜索均為新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽，將序列與已知抗菌肽序列進行對比結果發(fā)現(xiàn)新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽與已知抗菌肽中的保守序列有較大相似性，如對抗菌活性其關鍵作用的Pro、Trp，以及帶正電荷Lys、His等堿性氨基酸。而在和大腸桿菌孵育中未消失的組分由于疏水性較低、不帶正電荷等原因使之疏水性和電荷數(shù)未處在適合的平衡中，因此均表現(xiàn)為無抑菌活性。
　　 計算103種已知抗菌肽序列的平

5、均疏水性Q值，發(fā)現(xiàn)Q值多分布在-1.0～0.01間，經(jīng)分離實驗所得五種抗菌肽也屬于此范圍，表明適合的疏水性大小對抗菌肽的抗菌活性起關鍵作用，同時抗菌肽的疏水性殘基比率多分布在10％-70％，集中在40％-50％?？咕乃鶐粽姾煞植茧S抗菌肽的長度增加而顯著增加，此外，不同的作用機制對正電荷數(shù)目有不同要求。針對抗菌肽的肽序分析結果表明對于抗菌肽與微生物膜相互結合過程中起重要作用的疏水性和帶電荷性抗菌肽的疏水性和帶正電荷性質處在動態(tài)平衡關