Ⅱa型抗菌肽PCR篩選方法的優(yōu)化.pdf

1、消費者越來越關(guān)注食品添加劑與健康的關(guān)系。無防腐劑添加和化學(xué)物質(zhì)處理的自然、傳統(tǒng)的食物備受青睞。生物防腐已經(jīng)成為了未來食品防腐的趨勢,天然抗菌肽,因其天然、安全,受到研究者的矚目。傳統(tǒng)方法篩選抗菌肽存在工作量大、耗時較長、敏感性低的缺點。為彌補傳統(tǒng)篩選方法的不足,急需建立新型抗菌肽篩選方法。
　　本課題組已經(jīng)初步建立了基因篩選方法,檢測和篩選了傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的大量乳酸菌,獲得了1株產(chǎn)抗菌肽菌株。經(jīng)傳統(tǒng)方法證實,具有抑菌效果。表明該方

2、法具有一定的可行性。但是該方法仍存在著不足,缺乏高通量篩選的特質(zhì)。
　　本研究在初步PCR方法篩選的基礎(chǔ)上,對IIa型抗菌肽的PCR篩選方法進一步優(yōu)化,擬提高篩選效率;并且比較種屬特異性引物篩選與簡并引物篩選方法的優(yōu)劣,建立高效的篩選方法,進而為建立抗菌肽產(chǎn)生菌的高通量篩選模型奠定基礎(chǔ)。
　　本研究首先建立和優(yōu)化了發(fā)酵乳中宏基因DNA提取方法,并提取12份馬奶發(fā)酵乳的宏基因組DNA,用于初步篩選抗菌肽基因。此方法省去了事先篩

3、選菌株的繁重工作,提高了抗菌肽篩選的效率。對3份陽性馬奶發(fā)酵乳樣品進行乳酸菌的分離和純化,共獲得118株乳酸菌。采用菌落PCR方法篩選乳酸菌,最終篩選獲得了3株具有抗菌肽基因的菌株。經(jīng)過傳統(tǒng)抑菌實驗驗證,上述3株乳酸菌對李斯特菌均具有明顯的抑菌效果。以其中抑菌效果較好的菌株C71基因組DNA為模板,分別擴增了完整的抗菌肽基因和成熟的抗菌肽基因,構(gòu)建于表達載體pCold-SUMO上,獲得了4種重組質(zhì)粒。在嗜冷的大腸桿菌中,成功表達了抗菌肽

4、基因。本研究優(yōu)化了誘導(dǎo)表達的條件,確定了最佳的誘導(dǎo)時間為8h和最適IPTG濃度為0.2mmol/L。研究表明抗菌肽的前導(dǎo)肽對其抗菌活性無明顯影響。本實驗研究了煮沸法、裂解液溶解法、超聲破碎法三種方法破碎細胞的效果。其中超聲破碎法破碎菌體徹底,并且最大限度的保護了抗菌肽的完整性和活性。雙層牛津杯抑菌試驗結(jié)果表明,超聲波破碎菌體獲得的上清抑制李斯特菌效果明顯。以上結(jié)果表明抗菌肽基因成功表達。與原始乳酸菌相比,原核表達的抗菌肽表達量顯著提高,