半滑舌鰨抗菌肽高產(chǎn)菌株的篩選及表達(dá)條件優(yōu)化.pdf

1、抗菌肽（antimicrobial peptides）是一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，目前已發(fā)現(xiàn)了大約1900種，幾乎存在于所有的物種中。這種多肽具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、免疫原性較低、抗菌范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小等諸多優(yōu)點(diǎn)，在人和動(dòng)物病害防治中具有重要的應(yīng)用潛力。本研究以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的半滑舌鰨Hepcidin成熟肽的原核表達(dá)菌株為基礎(chǔ)，對(duì)80個(gè)重組菌株進(jìn)行了篩選，通過(guò)比較80個(gè)菌株蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖譜，篩選出

2、了蛋白表達(dá)量最多的菌株。對(duì)高效表達(dá)菌株的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，比較了該菌株在不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和不同誘導(dǎo)劑濃度下表達(dá)的目的蛋白SDS-PAGE圖譜，得到最佳表達(dá)條件是：誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600=0.6-0.7，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時(shí)間為10 h，誘導(dǎo)劑濃度為1.0 mM。
　　將實(shí)驗(yàn)室已獲得的半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）Hepcidin和NK-lysin成熟肽編碼基因分別連接到分泌型載

3、體 pINA1317和胞內(nèi)表達(dá)型載體pINA1312中，然后將這兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h構(gòu)建真核表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)測(cè)序的結(jié)果以及對(duì)酵母基因組序列的PCR擴(kuò)增，證明了兩種表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化均取得了成功。載體pINA1317和pINA1312質(zhì)粒的啟動(dòng)子是都是hp4d，不需要任何物質(zhì)誘導(dǎo)就可以表達(dá)外源基因，而解脂耶羅維亞酵母具有安全性高，生產(chǎn)的成本低，表達(dá)的蛋白活性高等優(yōu)點(diǎn)。半滑舌