暹羅鱷(Crocodylus siamensis)抗菌活性物質(zhì)的篩選及抗菌肽hepcidin基因的克隆表達.pdf

1、鱷魚是一類古老的爬行動物，在物種進化中占據(jù)重要的地位，其抗菌肽等免疫相關(guān)因子的研究相對較少。本論文在認真分析國內(nèi)外有關(guān)報道的基礎(chǔ)上，以人工養(yǎng)殖的暹羅鱷為對象，以探尋新的抗菌肽為目標(biāo)，應(yīng)用蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)、基因克隆及體外表達技術(shù)、結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析，主要取得了以下研究結(jié)果：
　　 (1)全面研究了暹羅鱷不同組織粗提物的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)血液、肝臟和卵巢提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌活性最強。暹羅鱷的新鮮血清可以抑制革蘭氏陽性菌和革

2、蘭氏陰性菌的生長，56℃滅活30 min后活性降低或喪失。用乙酸提取法制備的暹羅鱷白細胞粗提物對金黃色葡萄球菌和尖孢鐮刀菌具有明顯的抗菌活性。掃描電鏡結(jié)果顯示，粗提物處理30 min后，金黃色葡萄球菌菌體表面變得粗糙，有明顯的顆粒狀附著物，細胞壁有內(nèi)陷；處理60 min后，細胞嚴重萎縮、變形，附有大量膠塊狀物質(zhì)。處理后的尖孢鐮刀菌孢子形態(tài)由表面光滑的鐮刀狀變成了表面附有大量乳突狀物質(zhì)的球形。
　　 (2)通過蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合非

3、變性酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(AU-PAGE)純化了白細胞粗提物中的一種抗菌活性物質(zhì)，經(jīng)過Shotgun串聯(lián)質(zhì)譜分析，推測該活性物質(zhì)是組蛋白H1樣的蛋白或肽段，并將其命名為Cshistidin。
　　 (3)克隆了暹羅鱷hepcidin cDNA，其ORF編碼一個99-aa的前肽原preprohepcidin。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：暹羅鱷preprohepcidin包含一個25-aa的信號肽，一個48-aa的prodomain和

4、一個26-aa的成熟肽(命名為Cs-hepc)。Cs-hepc的分子量為2933.46 Da，理論等電點為8.53，構(gòu)建的Cs-hepc三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一個典型的β-sheet構(gòu)象。分別從DNA水平和蛋白質(zhì)水平上對暹羅鱷preprohepcidin進行了同源比對，構(gòu)建了preprohepcidin的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：相對于兩棲類和魚類，暹羅鱷preprohepcidin與哺乳類的親緣關(guān)系更近。
　　 (4)運用Real-time

5、 PCR研究了暹羅鱷hepcidin在健康鱷魚中的組織表達，結(jié)果表明：暹羅鱷hepcidin在肝臟、肌肉、心臟、腎臟、小腸、血液、脂肪、脾臟、性腺和肺中均有表達。其中肝臟表達量最高，其次是肌肉和心臟，肝臟表達量是肌肉表達量的八十多倍，是心臟表達量的三百多倍。腎臟中的表達量最低。
　　 (5)構(gòu)建了暹羅鱷hepcidin基因的原核重組表達質(zhì)粒pET-hepc。在E.coli表達系統(tǒng)中成功的誘導(dǎo)表達了融合蛋白Trx-hepc。用腸激

6、酶酶切后，獲得了與預(yù)期大小一致的目的產(chǎn)物，但是沒有檢測到明顯的抗菌活性。
　　 (6)合成了完全為酵母偏愛密碼子的編碼暹羅鱷hepcidin的基因Cs-hepc-pp，成功構(gòu)建了暹羅鱷hepcidin基因的三種真核表達重組質(zhì)粒，分別用于表達單一的暹羅鱷hepcidin成熟肽Cshepc、帶有組氨酸標(biāo)簽的Cshepc/6His、帶有組氨酸標(biāo)簽和分子伴侶c-cmyc的融合蛋白Cshepc/c-cmyc+6His。用甲醇誘導(dǎo)的方法在畢

7、赤酵母KM71中實現(xiàn)了目的產(chǎn)物的高效表達。活性分析表明：三種表達上清對四株細菌均有明顯的抑菌效果，其中Cshepc的活性最強，Cshepc/6His次之，Cshepc/c-cmyc+6His最弱。表達產(chǎn)物對芽孢枯草桿菌(Bacillussubtilis)的抑菌活性最強，50μg/ml的Cshepc可以抑制85.7％的B.subtilis的生長，對水產(chǎn)病原菌溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的活性較弱。用鎳柱親和層析法從表達