黃鱔抗菌肽hepcidin基因ORF的克隆與原核表達.pdf

1、抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的小分子物質，是生物天然免疫反應系統(tǒng)的重要成員，在生物體抵抗外界病原感染過程中起著非常重要的作用?？咕姆植际謴V泛，并且對大多數(shù)革蘭氏陰性或陽性菌、真菌、原生動物都有抑制作用，有些抗菌肽還具有抗寄生蟲、病毒和腫瘤的作用。
　　 本研究根據(jù)本實驗室構建的黃鱔腸道cDNA文庫中獲得的抗菌肽hepcidin基因ORF區(qū)（GenBank登陸號：GU997139）設計并合成特異性引物，利用RT-PCR技術從黃

2、鱔腸道總RNA中擴增出一條約300bp的目的基因片段。將目的基因片段克隆到pMD18-T載體上，序列測定結果表明與hepcidin基因ORF區(qū)完全一致。序列分析表明：該基因ORF區(qū)長273bp，編碼90個氨基酸，分子量約10236Da，包括24個氨基酸的信號肽、40個氨基酸的前域和26個氨基酸的成熟肽。結構預測顯示其屬于β-折疊類抗菌肽，包含有hepcidin類抗菌肽典型的8個半胱氨酸結構，形成4對二硫鍵。利用氨基酸序列進行同源比對，發(fā)

3、現(xiàn)黃鱔抗菌肽hepcidin與多種肉食性魚類的抗菌肽hepcidin同源性較高，其中與大黃魚的同源性最高，為81％。
　　 分別設計帶限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的特異性上、下游引物，以pMD18-T-hepcidin陽性克隆質粒為模板，亞克隆黃鱔抗菌肽hepcidin基因完整的ORF區(qū)(s-hepcidin)和不含信號肽的hepcidin基因(n-hepcidin)編碼序列，并插入原核表達載體pET32a(+)，

4、構建重組原核表達質粒pET32a(＋)-s-hepcidin和pET32a(+)-n-hepcidin。分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，在37℃，1mM IPTG誘導表達4h后，經SDS-PAGE電泳鑒定分析，pET32a(＋)-s-hepcidin陽性重組菌沒有表達出預期的目的蛋白；而pET32a(+)-n-hepcidin陽性重組菌明顯表達出目的融合蛋白，大小約為28KDa，與預期目的融合蛋白分子量大小一致。對pET