牦牛中性粒細(xì)胞抗菌肽分離純化、LAP基因克隆及原核表達(dá).pdf

1、內(nèi)源性抗微生物肽是生物體內(nèi)先天性免疫的重要組成成分，防御素(defensins)是廣泛分布于動(dòng)物和植物界的一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子內(nèi)源性抗微生物肽，是內(nèi)源性抗微生物肽中的一個(gè)大家族。是由生物細(xì)胞特定基因編碼，經(jīng)特定外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類多肽，具有抵抗外界微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的作用。根據(jù)防御素分子內(nèi)半胱氨酸的位置和連接方式、前體性質(zhì)及表達(dá)位置的差異可分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆蟲防御素和植物防御素五種類型。β-防御素

2、主要分布于哺乳動(dòng)物的黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，所以，β-防御素被確認(rèn)為黏膜表面抗微生物屏障的組成成分。 本試驗(yàn)以牦牛為實(shí)驗(yàn)材料，無(wú)菌采血，用40％聚蔗糖和76％復(fù)方泛影葡胺按一定比例配制成細(xì)胞分層液，以確定牦牛中性粒細(xì)胞及其他主要血細(xì)胞的漂浮密度。然后配制Percoll分層液通過密度梯度離心法分離純化牦牛中性粒細(xì)胞，用5％的冰乙酸抽提結(jié)合高速離心獲得中性粒細(xì)胞粗提物，并進(jìn)行了體外抑菌活性、溶血和對(duì)血細(xì)胞凝集的活性測(cè)定。活性檢測(cè)結(jié)果表明，

3、牦牛中性粒細(xì)胞粗提物對(duì)三種測(cè)試菌有很強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)兔和綿羊紅細(xì)胞沒有發(fā)生溶血現(xiàn)象，對(duì)兔血細(xì)胞稍有凝集(+)而對(duì)綿羊紅細(xì)胞無(wú)凝集。對(duì)牦牛中性粒細(xì)胞粗提物進(jìn)行了分離純化。通過Bio-Gel P-10凝膠過濾和反相高效液相色譜(RP-HPLC)，收集到牦牛中性粒細(xì)胞提取物樣品共22個(gè)峰，其中檢測(cè)出9個(gè)抑菌活性峰。選取有抑菌活性的9個(gè)峰進(jìn)行了質(zhì)譜分析。 在試驗(yàn)中我們以牦牛為材料，從牦牛舌黏膜上皮組織中提取總RNA，根據(jù)反芻動(dòng)物-牛β

4、-防御素eDNA的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出yLAP的eDNA，并重組到pGM-T載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜分析后進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果證實(shí)所克隆的yLAP的cDNA為β-防御素，因?yàn)樵揺DNA包含一個(gè)由192個(gè)堿基組成的開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，該ORF編碼64個(gè)氨基酸殘基的前原防御素肽，該前原防御素肽含有β-防御素的特征性結(jié)構(gòu)，即6個(gè)在特定位置上的保守半胱氨酸殘基。通過計(jì)

5、算機(jī)軟件分析其堿基分布、核苷酸和氨基酸同源性等。結(jié)果表明，yLAP基因與GenBank中已報(bào)道序列的同源性為99％：將yLAP和其他哺乳動(dòng)物β-防御素進(jìn)行aDNA堿基序列和前原肽氨基酸序列的同源性比較分析，結(jié)果顯示：yLAP與馴鹿、山羊和水牛的β-防御素序列一致性最高(91.7％，88.5％，93.1％)，與豬、驢和馬的β-防御素之間的次之(64.5％～73.3％)，與犬和恒河猴的β-防御素的最低(在30％以下)。由此可以看出yLAP的

6、cDNA序列與馴鹿、山羊和水牛的β-防御素親緣關(guān)系較近，這說明防御素進(jìn)化的多樣性。再以重組質(zhì)粒為模板，用特異性表達(dá)引物擴(kuò)增得到目的基因：即編碼yLAP的CDS片段(207bp)，將其定向克隆到pET-28a(+)表達(dá)載體中，構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-yLAP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，結(jié)果表明，成功表達(dá)出17KDa左右的目的蛋白。經(jīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃1mmol/L的IPTG在37℃，pH值7.2條件下誘導(dǎo)表達(dá)6h。