紫貽貝抗菌肽Defensin基因克隆與重組表達.pdf

1、抗菌肽又被稱為抗微生物肽，是生物體在免疫應(yīng)答過程中所形成的一種擁有廣譜抗病毒、細(xì)菌、真菌作用的活性多肽因子，相關(guān)科學(xué)研究已經(jīng)證明其是生物體先天免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵因子。鑒于無脊椎動物本身是缺乏特異性免疫機制，全部依靠其原有的免疫系統(tǒng)來抵抗防御病源的侵害，因此，對抗菌肽分子的挖掘和調(diào)控機制的研究有助于我們深入了解機體原有的免疫防御機制。
　　本研究通過EST測序，利用 cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)，從紫貽貝中克隆到了抗菌肽D

2、efensin基因的全長cDNA，該cDNA序列全長為481 bp，其中包含開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）是186 bp，編碼61個氨基酸；5'非編碼區(qū)（UTR）為95 bp，3'非編碼區(qū)（UTR）為200 bp，有ployA尾巴。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，紫貽貝抗菌肽Defensin包含成熟肽和信號肽兩個部分，其中成熟肽部分由38個氨基酸組成，信號肽由23個氨基酸組成。分析顯示，Defensin成熟肽包含18個疏水性氨

3、基酸，帶有5個凈正電荷，三級結(jié)構(gòu)分析顯示其包括α螺旋和β折疊片層結(jié)構(gòu)，這些都符合抗菌肽的凈正電荷、雙親性等基本特征。
　　本實驗利用實時熒光定量PCR的方法檢測了Defensin基因在紫貽貝6個組織（肝胰腺、鰓、性腺、外套膜、肌肉、血淋巴）中的表達情況。組織分布結(jié)果顯示，紫貽貝Defensin基因在六個組織中均有表達，其中Defensin基因在肝胰腺中的表達量最高，而在肌肉中的表達量最低。鰻弧菌刺激紫貽貝發(fā)現(xiàn)，血淋巴中Defens

4、in基因表達量在12和48 h時最高分別為20.3和20.6，在96 h時恢復(fù)到5.5；鰓中Defensin基因表達量在12 h時最高為9.6，在96 h時降低到5.4；而在肝胰腺中Defensin基因表達量逐漸升高在12 h時達到最大值5，之后逐漸減低在48 h時為1.05而后在96 h時升高到為1.56。
　　為了更深入的了解Defensin基因的抗菌活性，對Defensin基因的成熟編碼區(qū)添加BamH I和Hind III兩

5、種限制性內(nèi)切酶的酶切位點并對表達載體PET-32a(+)進行雙酶切處理，構(gòu)建重組表達載體，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達，得到的蛋白分子量為23.5 kDa，理論等電點為6.5。重組表達得到的rDefensin經(jīng)鎳柱純化、復(fù)性后進行抑菌實驗，實現(xiàn)結(jié)果顯示，rDefensin具有廣譜抗菌的特性，重組Defensin對藤黃微球菌、奇異變形桿菌、鰻弧菌以及產(chǎn)氣腸桿菌的殺傷作用比較明顯，最小抑菌濃度（MIC）分別是：0.45 mg/ml