斜帶石斑魚抗菌肽Hepcidin基因克隆、重組表達及口服免疫研究.pdf

1、Hepcidin是一類富含半胱氨酸殘基的抗菌肽家族，現(xiàn)在已經(jīng)被證實存在于多種魚類中并且有多變體現(xiàn)象。Hepcidin具有廣譜的抗微生物、抗病毒和腫瘤細胞的活性，還是維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的重要的調(diào)控因子。魚類Hepcidin在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有較廣闊的應(yīng)用前景。本研究通過分子生物學(xué)技術(shù)，從我國海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）中獲得抗菌肽Hepcidin基因，并揭示其表達特性，豐富我們對斜帶石斑魚先天免疫系統(tǒng)和先天免疫機制

2、的認識。在此基礎(chǔ)上，利用基因工程表達技術(shù)建立斜帶石斑魚Hepcidin的高效表達載體，研究其基因表達產(chǎn)物的抗菌活性，并研究口服灌胃表達產(chǎn)品對斜帶石斑魚的生理影響。主要研究成果如下:
　　 1.克隆獲得源于斜帶石斑魚Hepcidin基因序列。利用分子生物學(xué)技術(shù)從海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚肝臟RNA中克隆獲得3條Hepcidin基因變體，EC-Hepcidin1、EC-Hepcidin2和EC-Hepcidin3。通過RACE技術(shù)獲得了這3

3、條變體的全長cDNA序列。從斜帶石斑魚肝臟基因組DNA中克隆獲得了這3條變體的基因組DNA序列以及EC-Hepcidin1和EC-Hepcidin3基因組DNA上游調(diào)控區(qū)序列。這3條Hepcidin變體基因序列和基因結(jié)構(gòu)有很高的相似性，均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。生物信息學(xué)分析表明這3條Hepcidin變體編碼的多肽均由信號肽、前導(dǎo)肽和成熟肽組成。成熟肽中均含有4個半胱氨酸殘基，并且處于保守位點上。
　　 2.揭示了EC-H

4、epcidinmRNA的體內(nèi)組織器官分布和在病原誘導(dǎo)下的表達特性。利用Real-timePCR檢測EC-HepcidinmRNA在斜帶石斑魚各組織器官中的分布，結(jié)果顯示在所有測定的組織器官中均有檢測到EC-Hepcidin的表達，其中肝臟的表達量最高，是在其他組織器官中表達量的3000-1000000倍。揭示了EC-Hepcidin是斜帶石斑魚肝臟特異性表達的基因。檢測了細菌感染后斜帶石斑魚肝臟中EC-HepcidinmRNA的表達變化

5、。健康的斜帶石斑魚在經(jīng)過腹腔注射后，在細菌感染、福爾馬林滅活菌刺激和生理鹽水對照3個處理組中，肝臟EC-HepcidinmRNA均受到細菌和滅活菌不同程度的誘導(dǎo)而上調(diào)表達，分別在處理后12-24h及12h達到最高點。說明Hepcidin是斜帶石斑魚先天免疫的重要效應(yīng)分子，可以在抵抗外界刺激的過程中起到重要作用，對機體起保護作用。
　　 3.重組表達獲得EC-proHep3原核表達產(chǎn)物，研究其體外抗菌活性和殺菌動力學(xué)曲線。優(yōu)化條件

6、得到pET-28a/EC-proHep3(Rosetta)原核表達體系，可獲得可溶性重組蛋白EC-proHep3，經(jīng)一次親和純化后即獲得目的蛋白純品，分子量為12kDa，產(chǎn)量32.4mg/L菌液。體外抗菌實驗結(jié)果顯示，原核表達EC-proHep3能選擇性地抑制革蘭氏陽性和陰性菌，殺菌動力學(xué)曲線顯示12μM的純化重組蛋白EC-proHep3能夠在60min殺滅全部金黃色葡萄球菌，30min殺滅全部施氏假單胞菌。
　　 4.揭示EC

7、-Hepcidin蛋白體內(nèi)組織器官分布特點。利用EC-proHep3重組表達純化產(chǎn)物免疫Balb/c小鼠制備EC-proHep3多克隆抗體。通過間接ELISA法和westernblot法對抗體效價和抗體特異性進行檢測，結(jié)果顯示EC-proHep3多克隆抗體具有較高效價，可特異與EC-proHep3重組表達產(chǎn)物結(jié)合，滿足后續(xù)實驗需要。利用EC-proHep3抗體，通過SDS-PAGE、Westernblot檢測了EC-Hepcidin蛋白

8、體內(nèi)組織器官表達情況，發(fā)現(xiàn)在肝臟和腸道可檢測到Hepcidin蛋白。其中肝臟檢測到前多肽原和前體肽蛋白兩種形式的Hepcidin，而腸道檢測到較多Hepcidin前體蛋白。
　　 5.口服EC-proHep3重組純化產(chǎn)物，分析魚體免疫基因和鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因mRNA表達情況，并揭示單次灌胃EC-proHep3不會對機體造成氧化損傷和組織結(jié)構(gòu)損傷。使用Real-timePCR檢測口服灌胃EC-proHep3重組純化產(chǎn)物0h、3h、6h

9、、12h、24h和48h免疫相關(guān)基因TNFα-1、TNFα-2、IL1β、IL8和P65在腸道器官中的表達狀況，結(jié)果表明所測定的免疫相關(guān)基因的口服抗菌肽組與溶劑PBS組沒有顯著性差異。通過對肝臟和腸道鐵代謝相關(guān)基因FerroportinmRNA的檢測發(fā)現(xiàn)，肝臟中Ferroportin在3-24h呈現(xiàn)出先抑制而后逐漸升高的趨勢，48h達到最高。腸道Ferroportin基因在3h被顯著抑制，并繼續(xù)呈現(xiàn)基因表達下調(diào)的趨勢。通過血清MDA的檢