養(yǎng)殖真鯛、黑鯛抗菌肽hepcidin的基因克隆、表達特性及其抗菌活性研究.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptide)是一類具有廣譜抗微生物活性的天然小肽類物質(zhì),是先天免疫系統(tǒng)中重要的非特異性免疫因子。Hepcidin是2000年首先從人類中發(fā)現(xiàn)的一類富含半胱氨酸、性質(zhì)獨特的抗菌肽,其不僅具有顯著的抗微生物活性,還被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的鐵代謝調(diào)節(jié)因子,在魚類中分布廣泛。本論文以我國重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類-真鯛(Pagrus major)和黑鯛( Spagrus macrocephalus)為研究對象,較深

2、入的研究了hepcidin抗菌肽的基因結(jié)構(gòu)組成、器官、組織特異性分布、體外表達及其表達產(chǎn)物的抗菌活性,為開發(fā)應(yīng)用hepcidin抗菌肽奠定基礎(chǔ)。通過研究獲得了如下結(jié)果：1構(gòu)建了真鯛鰓cDNA文庫。以細菌攻毒的真鯛鰓為材料,提取并分離出mRNA,合成雙鏈后,回收500bp~4,000bp cDNA片段,構(gòu)建了λZAP表達型cDNA文庫。初級文庫的容量為1.75×105個重組子,擴增文庫的滴度達到1×109pfu/mL,隨機挑選重組克隆的插

3、入片段在500~2000bp之間。根據(jù)已發(fā)表的hepcidin序列的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物,以此引物做PCR擴增文庫,獲得了hepcidin抗菌肽基因cDNA片段(GenBank登錄號為AY574220)。該cDNA文庫的構(gòu)建為分離和篩選抗菌肽及其它免疫相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。2克隆獲得了真鯛、黑鯛hepcidin基因與基因不同變體cDNA序列。利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)從細菌感染后采集的

4、養(yǎng)殖真鯛肝臟和鰓分離到2條hepcidin cDNA序列(GenBank登錄號為AY557619、AY669383),從黑鯛的肝臟、脾臟、腎臟、鰓、皮膚和血液中分離出7條hepdidin cDNA序列(GenBank登錄號為AY669376~82),每條cDNA序列均包含完整的hepcidin編碼區(qū)及5′和3′非編碼區(qū),并且序列末端均具有明顯的多腺苷酸化加尾信號。從推導(dǎo)的真鯛、黑鯛hepcidin氨基酸序列(84~95aa),發(fā)現(xiàn)它們都