抗菌肽NK-2的分子克隆、融合表達(dá)及其抑菌活性的初步研究.pdf

1、抗菌肽是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，具有抗菌、抗病毒、抑制腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)。由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，不會(huì)誘發(fā)細(xì)菌的耐藥性，所以是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬?。目前，抗菌肽的制備主要有生物材料提取、化學(xué)合成和基因工程表達(dá)三種方法。抗菌肽在生物組織中含量低，分離程序煩瑣，提取的天然抗菌肽僅能用于氨基酸序列分析和抗菌等試驗(yàn)，難以滿足臨床應(yīng)用的需要；化學(xué)合成抗菌肽的價(jià)格昂貴，在獸醫(yī)臨床上沒有應(yīng)用價(jià)值；基因工程技術(shù)是生產(chǎn)抗菌肽的可行方法，并

2、取得了可喜的研究進(jìn)展和顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
　　 彈性蛋白樣多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)和內(nèi)含肽(intein)介導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)是最近幾年發(fā)展起來的新型原核表達(dá)系統(tǒng)，能利用ELP溫度誘導(dǎo)可逆相變特性和intein的自主剪切特性進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和裂解釋放，使重組蛋白的分離、純化過程大大簡(jiǎn)化，生產(chǎn)成本顯著降低。NK-2是天然殺傷(Natural Killer)細(xì)胞產(chǎn)生的溶解素(NK-lysi

3、n)核心區(qū)的一段小肽，分子量約為3.2kDa，具有廣譜的抗菌和抗原蟲活性，并對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不具有溶血性。
　　 本研究分別以pTYB11和pTWIN1為模板，通過PCR擴(kuò)增得Sce內(nèi)含肽和Ssp內(nèi)含肽編碼序列。用限制酶消化法去除原核表達(dá)載體pET-EIGFP中的△I-CM內(nèi)含肽和綠色熒光蛋白(GFP)編碼序列，將電泳分離回收的載體片段與Sce內(nèi)含肽和Ssp內(nèi)含肽連接，獲得的新載體分別命名為pET-ESI1和pET-ESI2。根據(jù)

4、NK-2序列設(shè)計(jì)引物，通過重疊延伸PCR擴(kuò)增出完整的NK-2編碼序列，將其插入表達(dá)載體pET-ESI2中，獲得重組表達(dá)載體pET-ESI2NK-2。以低溫誘導(dǎo)法誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)證明能表達(dá)預(yù)期分子量的融合蛋白前體ELP-Intein-NK-2。在不同溫度進(jìn)行反復(fù)離心洗滌結(jié)合(NH4)2SO4沉淀，獲得了較純凈的融合蛋白，并利用內(nèi)含肽的自主裂解特性獲得了預(yù)期大小的純化NK-2。以DH5a大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌