豬源抗菌肽PG-1的表達(dá)及其生物活性的初步研究.pdf

1、抗菌肽是動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以作為有效的、廣泛的、無(wú)選擇性的第一道防線來(lái)防御入侵的病原菌。已經(jīng)從各種各樣的資源中分離得到大量的抗菌肽，包括植物、昆蟲、低等脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物。豬源抗菌肽Protegrin-1(PG-1)最初由豬白細(xì)胞中分離得到，包括18個(gè)氨基酸，富含二硫鍵和精氨酸。PG-1的兩親性可以確保它作用于病原菌的細(xì)胞膜釋放胞內(nèi)物質(zhì)導(dǎo)致病原菌死亡，一些試驗(yàn)研究了PG-1的抗菌機(jī)理：PG-1單體在大量液體中都會(huì)發(fā)生二聚

2、化，PG-1可以和磷脂雙分子膜緊密結(jié)合，特別是陰離子膜，并且可以在磷脂雙分子膜中形成孔道造成不可控的離子轉(zhuǎn)運(yùn)，這是造成細(xì)胞死亡的主要因素。同時(shí)因PG-1具有廣譜的抗菌活性和不易產(chǎn)生耐藥性，PG-1被認(rèn)為是潛在的新藥候選者。在本研究中通過(guò)畢赤酵母P.pastorisX-33表達(dá)抗菌肽PG-1，并對(duì)其進(jìn)行純化和抗菌抗腫瘤細(xì)胞活性研究。
　　本試驗(yàn)根據(jù)成熟抗菌肽PG-1的氨基酸序列和P.pastorisX-33的偏好型密碼子全基因合成了

3、PG-1基因的核酸序列，并在這段核酸序列上游設(shè)計(jì)一個(gè)Xho I酶切位點(diǎn)，便于這段序列連在信號(hào)肽α-factor下游，在基因兩端分別添加編碼Kex2蛋白酶和6His-tag的核酸序列，在C端添加終止密碼子和Xba I酶切位點(diǎn)。并將PG-1基因克隆到真核表達(dá)載體pPICZa-A，空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI線性化后，電擊轉(zhuǎn)化到P.pastorisX-33。
　　選擇陽(yáng)性的酵母重組子接種到BMGY培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24h，當(dāng)

4、細(xì)胞濃度達(dá)到OD600為0.6時(shí)，收集細(xì)胞接種到BMMY培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)4～5天，每隔24h補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)，使甲醇濃度保持在1％。通過(guò)Tricine-SDS-PAGE的方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中表達(dá)的蛋白，通過(guò)Bradrford法測(cè)定粗蛋白的含量。將培養(yǎng)上清添加到鎳柱中進(jìn)行純化，PG-1的洗脫峰通過(guò)15% Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析，收集含有PG-1的那部分洗脫液，并測(cè)定蛋白含量。
　　采用液體生長(zhǎng)抑制法測(cè)定最小抑菌濃度

5、(MIC)，在96孔板中添加各稀釋濃度的樣品10μL，然后再添加100μL處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌體，培養(yǎng)一段時(shí)間后通過(guò)測(cè)定OD600來(lái)檢測(cè)其抑菌效應(yīng)。通過(guò)MTT法測(cè)定純化后抗菌肽PG-1對(duì)人肝癌細(xì)胞系細(xì)胞Hep G2細(xì)胞、人食管癌細(xì)胞系EC109和人胃癌細(xì)胞系MGC803的抑制作用，在96孔板中添加100μL的腫瘤細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后添加各個(gè)濃度的PG-1(10、20、40、80和160μg/mL)，培養(yǎng)1天后，加入20μL的5mg/mL MT

6、T(pH4.7)繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄液體，每孔再加150μL DMSO，振蕩10min充分融解結(jié)晶物，用分光光度儀(BioRad)測(cè)定各孔OD490值。
　　本試驗(yàn)成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPICZa-A-PG-1并通過(guò)酶切鑒定和核酸測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，將重組的載體轉(zhuǎn)化到P.pastorisX-33。Tricine-SDS-PAGE電泳的結(jié)果表明抗菌肽得到成功表達(dá)，并分泌到培養(yǎng)上清中，且分泌蛋白的分子量大小與預(yù)期設(shè)計(jì)的大小相符。培養(yǎng)上清經(jīng)鎳