富含不同陽(yáng)離子氨基酸抗菌肽的表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、眾所周知，在抗生素大量使用甚至濫用的今天，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生廣泛的耐藥性是醫(yī)療行業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)比較頭痛的問(wèn)題，雖然隨著科技的進(jìn)步尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多新藥以越來(lái)越快的速度被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但事實(shí)表明，新藥的開(kāi)發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的速度，因而目前出現(xiàn)的現(xiàn)象就是新藥使用越來(lái)越多，而細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生也越來(lái)越快。所以當(dāng)務(wù)之急是尋找和開(kāi)發(fā)細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性的藥物.抗菌肽就是其中的一個(gè)亮點(diǎn)，研究表明，細(xì)菌對(duì)抗菌肽不易產(chǎn)生抗藥性，抗菌肽對(duì)很多耐

2、藥性菌株都非常有效，因此將抗菌肽開(kāi)發(fā)為抗菌藥物成為當(dāng)今研究的熱門(mén)課題。
　　 目前已知的抗菌肽大部分是天然分離或人工合成的，含量少且成本高，這對(duì)于抗菌肽發(fā)展成為臨床應(yīng)用產(chǎn)品是極不現(xiàn)實(shí)的。而且天然的抗菌肽殺菌活較低，有的對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞還有一定的毒性。許多學(xué)者已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究來(lái)提高抗菌肽的活性并降低其毒性。本研究將幾種富含不同氧基酸的抗菌肽串連表達(dá)，以期作為復(fù)合抗菌肽研究其生物學(xué)活性，試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1選取G

3、enbank中的Protegrin-1、4kD Scorpion Defensin、Metalnikowin-ⅡA、SMAP-29、Thanatin和Moronecidin抗菌肽序列，它們富含不同的氨基酸，S MAP-29、Thanatin、Protegrin-1、4 kda Scorpion Defensin富含精氨酸或賴氨酸，Metalnikowin-ⅡA則富含脯氨酸、Moronecidin則富含組氨酸。將上述抗菌肽核苷酸序列用酵母

4、的Kex2酶裂解位點(diǎn)識(shí)別序列（gagaaaaga）串聯(lián)起來(lái)，并根據(jù)酵母偏好密碼子對(duì)其進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)成復(fù)合抗菌肽cp基因，克隆到酵母表達(dá)載體pPICZa-A中，轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母受體菌X-33中誘導(dǎo)表達(dá).Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)表明抗菌肽獲得了表達(dá)，表達(dá)量為271μg/mL.體外抑菌試驗(yàn)檢測(cè)表明表達(dá)的復(fù)合抗菌肽CP可以耐受至少30分鐘的高溫，在pH6～8時(shí)最穩(wěn)定，酸對(duì)其活性影響較堿小，對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為1.62

5、4μg/mL，135.5μg/mL的復(fù)合抗菌肽對(duì)小鼠紅細(xì)胞的溶血率為3.47％。
　　 2為了研究復(fù)合抗菌肽CP的抗菌活性及毒性，又從六種抗菌肽中選取MetalnikowinⅡ A（MET）和Scorpion Defensin（SD）分別在酵母中表達(dá)。參照酵母偏愛(ài)密碼子表，推導(dǎo)兩種抗菌肽的核苷酸序列，并對(duì)它們的C端進(jìn)行改造，分別用TD-PCR和PCR法獲得目的基因，在巴斯德畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，成功表達(dá)了上述兩種抗菌肽，

6、表達(dá)量分別為223μg/mL和131μg/mL。復(fù)合抗菌肽CP與它們相比活性比它們高3～7倍，而在熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性上CP和MET相似，都可以耐受至少30分鐘的高溫，在pH6～8時(shí)最穩(wěn)定，酸堿對(duì)它們均有影響，相比之下，堿的影響較大。復(fù)合抗菌肽CP的溶血率處于MET和SD兩者之間。
　　 3為了研究抗菌肽與抗生素之間的聯(lián)合藥效，為臨床減少抗生素的使用提供理論依據(jù)，選取幾種臨床常用的抗生素藥物（青霉素、鏈霉素、卡那霉素，環(huán)丙沙星，

7、新霉素、四環(huán)素、多粘菌素B、諾氟沙星、頭孢菌素），分別測(cè)定它們的最小抑菌濃度（MIC），初步探討3種抗菌肽分別與它們結(jié)合后的抗菌活性，并采用分級(jí)抑制濃度指數(shù)（FIC）來(lái)定量檢測(cè)抗菌肽與抗生素之間的抗菌作用關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗菌肽和抗生素對(duì)不同細(xì)菌的抗菌活性不同，三種抗菌肽與不同抗生素之間的抗菌協(xié)同關(guān)系因細(xì)菌種類而不同，三種抗菌肽與卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素及多粘菌素B聯(lián)用對(duì)幾種細(xì)菌都有不同程度的協(xié)同或相加作用，而與青霉素等抗生素則是不相關(guān)甚

8、至拮抗關(guān)系，說(shuō)明抗菌肽與抗生素之間并不是都存在協(xié)同關(guān)系，抗菌肽、抗生素與細(xì)菌三者的相互作用關(guān)系比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。
　　 4為了研究復(fù)合抗菌肽CP對(duì)ICR小鼠生長(zhǎng)和免疫機(jī)能的影響，將180只ICR小鼠隨機(jī)分為復(fù)合抗菌肽CP高、中、低劑量組，PBS對(duì)照組，空載體對(duì)照組及抗生素環(huán)丙沙星對(duì)照組。試驗(yàn)期35天，各組小鼠給藥途徑均為口服。期間觀察小鼠體重、采食量，第0、7、14、21、28、35天稱重，各組隨機(jī)取3只，眼球采血致死，

9、稱脾和胸腺重，取血清測(cè)定細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組全期平均日增重分別為0.644、0.638、0.62、0.63、0.632、0.614g/只，CP低、中劑量組增重高于PBS對(duì)照組，但差異不顯著（P>0.05），與其他各組相比差異也不顯著（P>0.05）；各組的料重比分別為7.66:1，7.52:1、8.71:1、7.84:1、7.87:1、8.16:1，低、中劑量抗菌肽組與PBS對(duì)照組相比，料重比明顯

10、降低，差異極顯著（P<0.01）。低中劑量復(fù)合抗菌肽CP組的胸腺和脾臟指數(shù)都呈增高趨勢(shì)，淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，抗菌肽各劑量組都高于PBS對(duì)照組，差異均極顯著（P<0.01），與空載體對(duì)照組相比，低劑量組差異極顯著（P<0.01）。抗菌肽低中劑量組IFN-γ和IL-2值與PBS對(duì)照組相比均有升高，而IL-4有所下降，三個(gè)劑量組抗菌肽都可以部分提供細(xì)菌感染保護(hù)作用，低劑量組保護(hù)率最高。結(jié)果表明，合適劑量的抗菌肽可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)小鼠淋

11、巴細(xì)胞增殖，保護(hù)小鼠抗細(xì)菌感染。
　　 5研究復(fù)合抗菌肽CP對(duì)ICR小鼠腸道菌群及腸道吸收能力的影響，提供抗菌肽的臨床應(yīng)用安全依據(jù)。將180只ICR小鼠分為復(fù)合抗菌肽CP高、中、低劑量組，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照組，空載體對(duì)照組和環(huán)丙沙星對(duì)照組。每隔一周采集小鼠十二指腸、空腸段于固定于4％甲醛溶液中，制作組織切片檢測(cè)雞十二指腸和空腸的絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度，計(jì)算絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度比值（V/C），并于第35天取直腸內(nèi)容物分離細(xì)菌。結(jié)果顯示，抗

12、菌肽試驗(yàn)組各種腸道菌的數(shù)量均低于對(duì)照組，且隨劑量增加數(shù)量越少；試驗(yàn)第0天，各組小鼠十二指腸絨毛、隱窩深度及V/C值基本相同，差異不顯著（P>0.05）；到第35天，A、B、E組小腸絨毛長(zhǎng)度，V/C值高于對(duì)照組，差異極顯著（P<0.01），隱窩深度低于對(duì)照組，差異極顯著（P<0.01），C組小腸絨毛長(zhǎng)度及V/C值低于對(duì)照組，隱窩深度高于對(duì)照組，差異極顯著（P<0.01）。說(shuō)明抗菌肽可以影響腸道菌群，但適當(dāng)劑量可改善小鼠腸道吸收能力，提高小