SK66抗菌肽的分子設(shè)計、優(yōu)化表達(dá)和生物學(xué)功能研究.pdf

1、昆蟲等無脊椎動物不具備特異性免疫系統(tǒng),但昆蟲的脂肪體會產(chǎn)生各種抗菌肽來應(yīng)對損傷和感染。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，昆蟲抗菌肽可分為四類：1、天蠶素類——形成兩性分子α-螺旋的抗菌肽；2、昆蟲防御素類——有分子內(nèi)二硫鍵的抗菌肽；3、富脯氨酸抗菌肽；4、富甘氨酸抗菌肽。果蠅作為一種模式昆蟲,為研究昆蟲和人類的先天免疫發(fā)揮了重要作用。目前對果蠅體內(nèi)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗菌肽多基因家族在分子進(jìn)化、抗菌功能的分子特征和免疫誘導(dǎo)表達(dá)的信號傳遞機(jī)制等方面的研究進(jìn)展

2、，進(jìn)一步加深了人們對昆蟲乃至其他動物和人類先天免疫模式的認(rèn)識，為研究其他昆蟲特別是作為主要農(nóng)林害蟲的鱗翅目昆蟲的先天免疫機(jī)制發(fā)揮了重要作用。
　　 我們從家蠅干蠅蛆中分離純化出了一個新富甘氨酸抗菌肽selysin。通過在基因庫對selysin同源搜索，我們在果蠅基因庫發(fā)現(xiàn)了兩個高度同源的富甘氨酸基因(GenBank accession no.nm_166597 and AY071315)。
　　 為此我們進(jìn)行了以下的研究

3、：
　　 1)通過序列分析和比對，我們設(shè)計并用RT-PCR方法從果蠅組織獲得了一個成熟DNA片段，該片段是這兩個基因富甘氨酸結(jié)構(gòu)域的一部分，編碼了一個氮端是絲氨酸，碳端是賴氨酸含有66個氨基酸殘基的多肽SK66。
　　 2)將富甘氨酸果蠅抗菌肽SK66基因的核心片段構(gòu)建表達(dá)載體pET32a+中，經(jīng)測序證實(shí)基因序列的正確性后。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Ecoli BL21(DE3)。在不同溫度、不同時間、不同OD值和不同IP

4、TG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)，研究表明在37℃菌液OD 值0.8時誘導(dǎo)7小時蛋白表達(dá)量最高（IPTG 0.7 mM，AMP 100 ug/ml，0.3%Glu。獲得了抗菌肽表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件。
　　 3)通過親和層析我們有效的純化了SK66－h(huán)is，每升誘導(dǎo)的大腸桿菌中能夠純化10毫克；通過最小抑菌濃度實(shí)驗，其殺菌活性高低依次為：枯草桿菌>蘇云金芽胞桿菌>金黃色葡萄球菌，最低殺菌濃度依次為：0.009、0.019、0.039μg/μl。銅綠

5、假單孢菌和大腸桿菌的最低殺菌濃度在5μg/μl是沒有檢測到。對G+菌的殺滅作用比對G-菌強(qiáng)，對抗菌藥物的開發(fā)有重要意義。
　　 4)SK66－h(huán)is能殺滅子宮頸癌細(xì)胞Hela。經(jīng)SK66－h(huán)is處理后，子宮頸癌細(xì)胞Hela的貼壁性很快被破壞，大量細(xì)胞懸浮并死亡。通過MTT實(shí)驗，我們發(fā)現(xiàn)SK66－h(huán)is能夠顯著抑制子宮頸癌細(xì)胞Hela的增殖。采用膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SK66－h(huán)is能在DRG細(xì)胞上形成陽離子通道。說明SK66－h(huán)is對

6、癌細(xì)胞和細(xì)菌的殺滅機(jī)制可能相同：細(xì)胞膜出現(xiàn)大量穿孔、原生質(zhì)泄漏，細(xì)胞破裂死亡。
　　 5)為了研究SK66的抗菌機(jī)制，我們?nèi)诤媳磉_(dá)并純化了一個融合蛋白Trx-SK66，用腸激酶（enterokinase）裂解該融合蛋白. 將裂解后的溶液多肽進(jìn)一步用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離、收集各洗脫峰、凍干成功制備了AMA-SK66，該蛋白在SK66的氮端加了三個非極性氨基酸：2個丙氨酸和一個甲硫氨酸。通過對SK66－h(huán)is、AM