豬小腸抗菌肽CecropinP1在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其生物活性研究.pdf

1、無論是在畜牧業(yè)還是在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，抗生素已經(jīng)成為臨床治療病原感染的有力武器。同時抗生素還可作為畜禽飼料添加劑在畜禽疾病預(yù)防和促生長方面發(fā)揮重要作用。但是，抗生素的亂用與濫用，造成了許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，且耐藥菌株出現(xiàn)的速度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗生素新藥的開發(fā)速度，使抗感染治療陷入耐藥菌的危機(jī)中；抗生素作為飼料添加劑的廣泛使用，也嚴(yán)重破壞了畜禽腸道的微生物平衡，而且在畜產(chǎn)品體內(nèi)積蓄殘留，帶來了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生隱患。 有鑒于此，“無毒，無殘留，無

2、耐藥性”是新一代抗菌制劑的發(fā)展趨勢和要求?？咕?antibacterial pcptidcs)是生物體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性多肽活性物質(zhì)，是生物體先天免疫的重要組成成分(Boman，1991)。由于其獨(dú)特的抗菌機(jī)制，不會誘發(fā)細(xì)菌的耐藥性，成為具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩?目前抗菌肽的制備主要有生物材料提取、化學(xué)合成和基因工程表達(dá)3種方法?？咕脑谏锝M織中含量低，且分離程序煩瑣，獲得的樣品

3、僅僅用于氨基酸序列分析和初步的抗菌試驗(yàn)，難以滿足應(yīng)用需要；化學(xué)合成法合成差錯隨著目的肽段的增大而增加(一般超過50個氨基酸殘基的肽段難以用化學(xué)合成法合成)，并且其合成價格昂貴；基因工程方法是目前大量表達(dá)抗菌肽使其成為新一代肽類抗菌藥物更為現(xiàn)實(shí)的途徑，顯示出其廣闊的前景。多種抗菌肽已在不同的表達(dá)體系中得到表達(dá)，如天然抗菌肽天蠶素A和B已在昆蟲系統(tǒng)中得到表達(dá)；柞蠶抗菌肽D和綠蠅抗菌肽在酵母系統(tǒng)中得到表達(dá)；天蠶抗菌肽A在真核系統(tǒng)中得到表達(dá)等等

4、。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究豬小腸抗菌肽cccropin P1及其體內(nèi)外抗菌活性，為重組抗菌肽cecropin P1的工程化生產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生健康奠定基礎(chǔ)。本研究主要從以下幾個方面展開。 1、選用畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)并人工合成豬小腸抗菌肽cecropin P1基因，全長117bp。基因N端引入a-交配信號肽kex 2裂解位點(diǎn)，以保證表達(dá)抗菌肽具有天然N端；C端引入谷氨酰胺增加抗菌肽的酰氨化程度，以

5、增強(qiáng)廣譜抗菌活性。此外，基因的兩端分別引入兩個限制性酶切位點(diǎn)Xho Ⅰ和Xba Ⅰ?？咕幕虮豢寺∪雙PICZa-A質(zhì)粒，成功構(gòu)建了分泌型重組酵母表達(dá)載體pPICZa-A-cecP1。將重組質(zhì)粒Sac Ⅰ線性化后電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastoris SMD1168。在AOX1(醇氧化酶)啟動子調(diào)控下，類似天然抗菌肽大小的目的蛋白獲得分泌表達(dá)。初步抑菌活性測定顯示其對致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Cowan Ⅰ)、鼠傷寒沙門氏菌和枯

6、草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抑殺活性。 2、SMD1168菌株由于蛋白酶A和羧肽酶Y活性全部缺失，僅存部分蛋白酶B活性，這樣非常有利于發(fā)酵液中重組抗菌肽表達(dá)物的穩(wěn)定。筆者對cecropin P1重組酵母菌的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了表達(dá)優(yōu)化和生物學(xué)活性研究，結(jié)果顯示當(dāng)含有重組酵母菌的BMGY培養(yǎng)液OD600達(dá)到7～8時轉(zhuǎn)接pH值為6.0 BMMY培養(yǎng)基，每24h補(bǔ)加0.5％甲醇，并于28℃培養(yǎng)72h后，抗菌肽cecropin P1可獲得高效表

7、達(dá)。根據(jù)瓊脂孔擴(kuò)散法，對重組抗菌肽的酸、堿、熱穩(wěn)定性和抑菌效價等生物學(xué)特性進(jìn)行檢測。 3、以昆明種小鼠為對象，初步研究了重組抗菌肽cecropin P1防治小鼠細(xì)菌感染的效果。通過預(yù)試驗(yàn)，確定了選用的金黃色葡萄球菌(Cowan Ⅰ)和致病性大腸桿菌K99對小鼠的最小致死劑量(MLD<,100>)和抗菌肽體內(nèi)保護(hù)劑量的參考值。在預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射cecropin P1重組抗菌肽240μg的小鼠，2h后分別腹腔注射致死劑量金黃色