抗菌肽LL-37和Misgurin基因合成及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、抗菌肽是存在于生物體內具有抵抗外界微生物侵害，消除體內突變細胞的一類由生物細胞特定基因編碼產(chǎn)生的小分子多肽，多具有廣譜的抗菌活性，是生物機體先天性免疫防御體系的重要組成部分。目前已從包括兩棲動物、昆蟲、哺乳動物、植物、原核生物中分離到超過2000種具有抗細菌、真菌和病毒等抗菌活性的抗菌肽。但從生物體提取抗菌肽根本無法滿足實際應用的需要，而化學合成抗菌肽又太昂貴。因此利用基因工程的方法將人工合成的抗菌肽基因導入宿主細胞，再通過微生物發(fā)酵的

2、方法生產(chǎn)抗菌肽更具實際意義。本研究的目的就是應用基因工程技術獲得重組的人源抗菌肽LL-37和來自泥鰍的抗菌肽Misgurin，以期為工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應用打下基礎。
　　 根據(jù)GenBank中LL-37（P49913）和Misgurin（P81474）中的氨基酸序列，選用酵母偏愛密碼子設計相應的抗菌肽基因L和M。并在它們的N端都引入了α交配因子信號肽Kex2酶切位點，以保證表達的抗菌肽具有天然的N端。C端引入谷氨酰胺以增加抗菌肽的

3、酰胺化程度，增強其抗菌活性。然后分別將抗菌肽基因L和M克隆至酵母分泌型表達載體pPICZα-A中，構建重組真核酵母表達質粒pPICZα-A-L和pPICZα-A-M。測序結果表明，LL-37和Misgurin的基因已正確亞克隆至真核表達載體pPICZα-A上。
　　 大量提取重組真核表達載體質粒，并以pPICZα-A表達載體為對照，經(jīng)SacⅠ線性化后電轉化法轉化至酵母菌SMD1168株。經(jīng)濃度逐步增加的ZeocinTM抗性YPD

4、S平板篩選獲得高拷貝的陽性重組酵母菌pPICZα-A-L/SMD1168和pPICZα-A-M/SMD1168。在含甘油的BMGY培養(yǎng)基增菌至OD600達5～6后，轉至含有甲醇的誘導培養(yǎng)基BMMY中進行搖瓶發(fā)酵，每隔24h補加100％甲醇使終濃度達0.5％。采用瓊脂孔擴散法進行抑菌活性測定，結果顯示重組酵母菌pPICZα-A-L/SMD1168和pPICZα-A-M/SMD1168的表達上清都具有廣譜抗菌活性，對金黃色葡萄球菌Cowan