雜合抗菌肽HMCM和TP508融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及青蒿無(wú)性繁殖技術(shù)研究.pdf

1、抗菌肽因其殺菌的高效性、廣譜性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。雜合抗菌肽是一類(lèi)新型抗菌肽，它由來(lái)自兩種或多種抗菌肽的部分肽鏈組成，具有高效、廣譜、低毒、肽鏈較短等特點(diǎn)。人工設(shè)計(jì)雜合肽是研究的熱點(diǎn)之一，即選擇一種抗菌肽為藍(lán)本，對(duì)某些氨基酸做刪減替換或與另外一種抗菌肽的片段拼接。研究表明，一些經(jīng)過(guò)改造的抗菌肽具有與藍(lán)本相似或更高的活性，毒副作用降低，而且變短的肽鏈為降低合成成本也奠定了基礎(chǔ)。為了解

2、決抗菌肽直接提取純化困難、化學(xué)合成法成本較高、原核表達(dá)產(chǎn)物可能導(dǎo)致活性喪失并對(duì)宿主有害且難以純化等問(wèn)題，選擇真核表達(dá)系統(tǒng)成為基因工程表達(dá)抗菌肽的理想選擇。
　　 因此，探索并設(shè)計(jì)新肽，改善原有抗菌肽的活性，降低或消除他們的溶血性，高效表達(dá)目的小肽對(duì)解決目前抗菌肽存在的問(wèn)題都有著重要的意義和實(shí)驗(yàn)價(jià)值。目前，源自不同藍(lán)本的雜合抗菌肽研究頗多，從不同方面達(dá)到或接近了預(yù)期效果;鑒于還未見(jiàn)四段不同類(lèi)抗菌肽雜合的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)做了一個(gè)大膽的創(chuàng)

3、新，由四段Hexapeptide(6)-Magainin(1-12)-CecropinA(1-7)-Melittin(5-12)拼接成雜合抗菌肽HMCM。
　　 為了加強(qiáng)雜合抗菌肽在臨床上的實(shí)用性，在保留原有活性的基礎(chǔ)上，本課題基于對(duì)活性抗菌肽構(gòu)效關(guān)系的深入研究，將凝血酶激活肽TP508融合在HMCM的合理部位以增強(qiáng)其在臨床應(yīng)用時(shí)對(duì)傷口的愈合作用，同時(shí)，在目的蛋白N端增加一個(gè)6×His Tag以便于蛋白的分離純化，以期為大量生產(chǎn)

4、高效雙功能抗菌肽提供有效的基因工程手段。
　　 本研究首次在畢赤酵母真核表達(dá)體系中表達(dá)了雜合抗菌肽和人凝血酶激活肽受體TP508融合蛋白，根據(jù)設(shè)計(jì)的融合蛋白氨基酸序列和畢赤酵母的密碼子偏好性，設(shè)計(jì)了六條引物經(jīng)三輪PCR獲得目的基因。將目的基因與畢赤酵母載體pPIC9K質(zhì)粒重組構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115宿主菌，經(jīng)G418篩選得到高表達(dá)的陽(yáng)性克隆，篩選鑒定為甲醇利用快型(Mut+)菌株，在搖瓶中實(shí)現(xiàn)融合蛋白的高效、穩(wěn)定和

5、分泌性表達(dá)。培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾離心、親和層析純化到單一的目的蛋白。
　　 同時(shí)，針對(duì)青蒿的自交不親和性而引起的高青蒿素含量植株后代株系遺傳不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，開(kāi)展扦插生根研究，通過(guò)植物生長(zhǎng)素促進(jìn)青蒿生根，從而保持高青蒿素含量青蒿后代的遺傳穩(wěn)定，突破了青蒿素含量這一性狀不穩(wěn)定的瓶頸。
　　 青蒿素是青蒿最重要的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)研究高青蒿素含量青蒿的繁殖方法，以提高青蒿中青蒿素的含量，探討用不同類(lèi)型植物生長(zhǎng)激素對(duì)促進(jìn)青蒿的無(wú)性繁殖的影響