畢赤酵母高效表達(dá)融合蛋白的環(huán)境和控制條件研究.pdf

1、本論文以DO-Stat法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)模式識(shí)別控制法(ArtificialNeuralNetworkPatternRecognitionbasedcontrol，ANNPR-Ctrl)為手段，對(duì)畢赤酵母流加培養(yǎng)生產(chǎn)融合蛋白HSA-IL-2過(guò)程中的甘油流加控制策略和性能指標(biāo)進(jìn)行了比較研究。在細(xì)胞生長(zhǎng)期采用基于DO(溶解氧)/pH在線(xiàn)測(cè)量的ANNPR-Ctrl法特別有效。它可以有效地增加細(xì)胞的生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短培養(yǎng)時(shí)間，使以甲醇為誘導(dǎo)劑的融

2、合蛋白的誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)間大幅提前。但是，在誘導(dǎo)期，甲醇濃度必須控制在一定水平才能實(shí)現(xiàn)融合蛋白的有效表達(dá)。同時(shí)，重組畢赤酵母菌(KM71，Muts)利用甲醇能力弱，無(wú)法利用DO和pH判斷甲醇的過(guò)量或匱乏的狀況。因此，在誘導(dǎo)期使用甲醇在線(xiàn)電極來(lái)控制甲醇流加，可以將甲醇濃度控制在設(shè)定范圍之內(nèi)，實(shí)現(xiàn)融合蛋白的有效表達(dá)。 利用重組畢赤酵母菌(KM71，Muts)表達(dá)生產(chǎn)人白蛋白修飾的白介素-2(HSA-IL-2)過(guò)程中，DO和甲醇濃度是影響目

3、標(biāo)蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSA-IL-2生產(chǎn)菌對(duì)DO的需求不是很高，通過(guò)使用空氣并結(jié)合調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速就能滿(mǎn)足其對(duì)DO的需求。誘導(dǎo)3天后，在正常DO、較低甲醇濃度下(DO20-60％，甲醇濃度5-8g/L)，HSA-IL-2表達(dá)量為23mg/L，為搖瓶表達(dá)量的2.5倍；在高DO、低甲醇濃度(DO80％-120％，甲醇濃度2-5g/L)下，HSA-IL-2表達(dá)量可進(jìn)一步提高18％，達(dá)到27mg/L；DO振蕩、低甲醇濃度(甲醇濃度2-7g

4、/L)條件不利于HSA-IL-2的表達(dá)；在正常DO、較高甲醇濃度下(DO20-60％，甲醇濃度1.5-23g/L)，HSA-IL-2表達(dá)量最高，達(dá)到44.6mg/L。誘導(dǎo)前期，甲醇濃度過(guò)高易導(dǎo)致菌體中毒，不利于HSA-IL-2的表達(dá)。此外，在誘導(dǎo)階段，通過(guò)限制性添加甘油可以有效提高菌體的呼吸活性，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，并且緩解甲醇對(duì)菌體的毒性。 本文還對(duì)重組畢赤酵母菌(GS115，Mut+)表達(dá)融合蛋白HSA-CP進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)

5、現(xiàn)該菌對(duì)DO的需求很高。通富氧空氣(50％，V/V)時(shí)最高菌體濃度OD600可達(dá)到600，約為通空氣時(shí)相應(yīng)值的1.8倍。與HSA-IL-2生產(chǎn)菌相比，該菌的誘導(dǎo)特性也不同。它利用甲醇能力強(qiáng)、誘導(dǎo)時(shí)間短，在5L發(fā)酵罐誘導(dǎo)15h內(nèi)，HSA-CP蛋白表達(dá)量就可以達(dá)到最大值，而相應(yīng)的搖瓶水平的最大蛋白表達(dá)量要在誘導(dǎo)3天才能達(dá)到。使用空氣時(shí)HSA-CP最高表達(dá)量為108mg/L，略低于搖瓶；而通富氧空氣時(shí)HSA-CP最高表達(dá)量可提高一倍，達(dá)到23