重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)融合蛋白在畢赤酵母中的表達、純化和檢測.pdf

1、白介素-2(interleukin-2)又稱T細(xì)胞生長因子，是輔助T淋巴細(xì)胞分泌的淋巴因子，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。它能促進T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞的分化、成熟及激活其生物活性，促進許多淋巴因子如干擾素、腫瘤壞死因子等的合成與釋放以及抗體生產(chǎn)；有發(fā)動、促進和廣泛上調(diào)免疫系統(tǒng)的作用，同時IL-2能大大增強機體免疫功能，對很多感染性疾病有治療作用，對某些腫瘤和艾滋病的防治有良好的效果，對免疫缺陷癥有較好的潛在療效。天然人IL-2是一

2、個133個氨基酸殘基組成的多肽，為分子量大約有15KDa的糖基化蛋白。有3個半胱氨酸殘基分別位于第58、105和125位。因此翻譯后修飾還包括Thr位點的糖基化和在第58位與第105位殘基形成二硫鍵。糖基化與否對蛋白活性沒有影響，而正確的二硫鍵對活性是必須的，因此重組的IL-2通常將125位游離的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸或者丙氨酸，這樣就有利于重組蛋白產(chǎn)生正確的二硫鍵。目前，人IL-2(125ser)已采用基因工程方法生產(chǎn)；但其在人體內(nèi)

3、半衰期僅為6.9min，為了達到治療效果，不得不頻繁給藥，不但增加了病人的痛苦和治療費用，而且易引發(fā)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)。
　　 為了延長IL-2(125ser)在體內(nèi)作用的半衰期，本研究設(shè)計了一種IL-2(125ser)與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的融合蛋白。HSA是由585個氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為66.5 kD。作為血漿的重要成分之一，HSA是許多內(nèi)源因子和外源藥物的

4、載體，正常情況下不易透過腎小球。在血漿中的半衰期長達2周，體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，因而是一種理想的生物活性蛋白載體。通過基因工程技術(shù)將HSA基因與基因相連接，使IL-2(125ser)在不喪失生物活性的情況下，在血漿中的半衰期能夠得到顯著地延長。從而，HSA-IL-2(125ser)融合蛋白就可降低給藥頻率，卻能發(fā)揮出與IL-2(125ser)相似的藥效作用，具有較好的應(yīng)用前景，并為進一步研究蛋白類藥物的長效性提供依據(jù)。<

5、br>　　 根據(jù)上述背景，本研究分為以下四部分內(nèi)容：
　　 第一部分：重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)融合蛋白(rHSA/IL-2(125ser))酵母表達菌株的構(gòu)建應(yīng)用分子克隆技術(shù)，PCR方法獲得HSA，IL-2(125ser)基因。在設(shè)計PCR引物時，在HSA基因5'-端添加限制性內(nèi)切酶XhoI切點，且在XhoI點與HSA結(jié)構(gòu)基因的5'-端之間插入Kex2蛋白酶酶切位點的氨基酸殘基Lys-Arg對應(yīng)的密碼子(AA

6、AAGA)，保證在甲醇酵母分泌表達融合蛋白時能夠順利切除信號肽序列，分泌產(chǎn)生的HSA同天然的HSA的N-端序列完全相同，將HSA基因的3'-端和IL-2(125ser)基因的5'-端之間添加限制性內(nèi)切酶BamHI位點(GGATCC)，也就是相當(dāng)于用Gly和Ser兩個氨基酸殘基將HSA和IL-2(125ser)蛋白連接起來，在IL-2(125ser)基因的3'-端添加了終止密碼子(TGA)和限制性內(nèi)切酶NotI的序列。將酶切回收后的基因H

7、SA(XhoI-BamHI)、IL-2(125ser)(BamHI-NotI)和載體pPICZα(XhoI-NotI)建立連接反應(yīng)，獲得pPICZα-HSA-IL-2(125ser)質(zhì)粒，酶切和測序電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，利用不同濃度的抗生素zeocin篩選高表達株，通過PCR顯示融合基因已經(jīng)成功整合到酵母的基因組中。在搖瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)后，SDS-PAGE和Westeron blot分析表明HSA-IL-2(125ser)基因在畢赤酵母X

8、33中能有效分泌表達，表達產(chǎn)物分子量約為82KD。
　　 第二部分：重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)融合蛋白(rHSA/IL-2(125ser))高密度發(fā)酵工藝的研究對影響畢赤酵母表達的主要因素如誘導(dǎo)pH、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間等進行了篩選。確定了rHSA/IL-2(125ser)在發(fā)酵罐上的高密度發(fā)酵的工藝，產(chǎn)物表達量可達200mg/l。
　　 第三部分：重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)融合蛋白(rHS

9、A/IL-2(125ser))純化條件的研究對發(fā)酵上清，用陽離子交換層析(capto MMC)，疏水層析(Phenl SepharsoseFF)，分子篩層析(Superdex200 prep grand)等組合純化方法，分離純化發(fā)酵液中的rHSA/IL-2(125ser)融合蛋白，并對最終制備的樣品用SDS-PAGE，RP-HPLC檢測，純度大于95％。
　　 第四部分：重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)融合蛋白(rHS

10、A/IL-2(125ser))檢測參照中國藥典三部(2010年版)有關(guān)重組蛋白原液的檢測要求，重點對重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)原液的含量，生物學(xué)活性，純度，鑒別試驗，外源性DNA殘留量及殘余工程菌蛋白含量等研究項目進行了研究。證實rHSA/IL-2(125ser)原液的各項指標(biāo)均符合藥典規(guī)定。
　　 本研究構(gòu)建了高效表達的重組人血白蛋白-白介素-2(125ser)酵母菌株，篩選了高密度的發(fā)酵條件，發(fā)酵產(chǎn)量可達20