畢赤酵母生產重組人白介素11的發(fā)酵工藝研究.pdf

1、本文首先通過搖瓶實驗對巴斯德畢赤酵母高效表達重組人白介素11的發(fā)酵條件、防止表達產物降解和聚合等方面進行了優(yōu)化;根據優(yōu)化的結果進行了補料分批發(fā)酵和放大，并對表達產物進行了鑒定。實驗結果如下:
　　1.考察了影響外源蛋白表達的因素，對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)及誘導條件為:接種量為10％，最佳種齡菌體密度OD600在10到20之間，誘導菌體密度OD600在120-150，誘導時間為70小時，甲醇濃度為0.5％，pH誘導前為6.

2、0，誘導后為6.8，發(fā)酵溫度為誘導前30攝氏度，誘導后降為25攝氏度，誘導48小時后降為22攝氏度。
　　2.實現對外源蛋白表達條件的優(yōu)化，減少目的蛋白的降解和聚合。對小罐試驗的結果進行了放大，用德國貝朗公司D100型150L發(fā)酵罐進行了補料，分批發(fā)酵。最佳的實驗條件為:
　　甘油培養(yǎng)階段:甘油濃度為40g/L，培養(yǎng)溫度為30℃，pH6.0，溶氧40％。甘油流加階段:等第一階段甘油耗盡（溶氧突然躍升）即可進行甘油流加，50％

3、甘油(含12ml/L PTMl)以24mL/L/h的速率進行補加，約4小時后，OD600大概在120-150左右，停止補加。
　　甲醇流加階段:等第二階段結束后，饑餓半小時左右。等溶氧和pH均明顯上升后，添加0.5％濃度的甲醇，待甲醇流量檢測器讀數穩(wěn)定后，以該讀數值為控制點進行100％甲醇（含12ml/L PTMl）反饋流加。誘導初期添加1％酵母粉、2％蛋白胨、0.3％干酪素、5mM EDTA、0.1M精氨酸及0.1％吐溫20，溫

4、度控制在25℃，pH6.8，此后每隔24h添加一次0.3％干酪素和0.1％吐溫20，誘導48小時后溫度降為22℃?？傉T導時間約70h。放罐時發(fā)酵總體積約90L，發(fā)酵上清約60L，蛋白表達總量在1.2g/L以上。該工藝共分三個階段，約95h，整個過程pH用濃氨水控制，溶氧用空氣和氧氣混合控制。
　　3.通過SDS-PAGE凝膠電泳法對表達產物進行了定性分析，結果表明表達產物與rhIL-11標準品具有相同的相對分子量。通過以上多方面的