重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的策略研究.pdf

1、堿性果膠酶(E.C.4.2.2.2)，簡稱PGL,是指在堿性環(huán)境下具有高活性的一類果膠酶，可以通過以反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的α-1，4—糖苷鍵并釋放出不飽和的寡聚半乳糖醛酸。堿性果膠酶作為煮練助劑用于紡織纖維的脫膠預(yù)處理，對(duì)纖維膠質(zhì)有較好的去除作用，且對(duì)天然纖維素纖維損傷較小。因此，以堿性果膠酶為關(guān)鍵技術(shù)的生物酶精練替代傳統(tǒng)的化學(xué)精練工藝，不僅可解決環(huán)境和能源等問題，而且可提高棉紡織物的品質(zhì)。 本論文前期研究基礎(chǔ)為：從分離篩

2、選得到的一株堿性果膠酶高產(chǎn)菌株Bacillussp.WSHB04—02，擴(kuò)增出編碼堿性果膠酶的基因，成功表達(dá)于PichiapastorisGS115。在此基礎(chǔ)上，本論文通過詳盡分析菌體和甲醇濃度對(duì)重組P.pastorisGS115高效表達(dá)的影響，得出誘導(dǎo)階段甲醇濃度和菌體濃度的最佳比值；通過菌體生長階段甘油的指數(shù)流加和誘導(dǎo)階段甲醇分階段流加策略控制甲醇和菌體濃度的最佳比值，實(shí)現(xiàn)了PGL的高效表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，探討了誘導(dǎo)溫度對(duì)畢赤酵母表達(dá)

3、系統(tǒng)中外源蛋白降解的作用。主要研究結(jié)果如下： 1)為提高重組P.pastorisGS115發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，在搖瓶中優(yōu)化了重組畢赤酵母生產(chǎn)堿性果膠酶的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明，初始甘油濃度40g/L、初始甲醇濃度9％，按每24h添加1.5％，誘導(dǎo)表達(dá)周期72h、250mL三角瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基裝液量30mL、初始pH6.0，最適于菌體生長與產(chǎn)物表達(dá)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體干重可達(dá)40g/L，PGL酶活可達(dá)130.6U/mL；

4、 2)當(dāng)誘導(dǎo)初始階段菌體濃度分別為62.5g/L和90g/L時(shí)，甲醇用于細(xì)胞生長，而是PGL生產(chǎn)能力受限；當(dāng)誘導(dǎo)階段初始菌體濃度為122g/L，甲醇幾乎不用于細(xì)胞生長，而是高效地用于誘導(dǎo)產(chǎn)酶。控制體系中甲醇濃度為20g/L時(shí)，PGL酶活最高并且生產(chǎn)強(qiáng)度最大，分別為376U/mL和4.06U/mL/h。另外，在一定菌體濃度下，一定范圍內(nèi)增加甲醇和菌體濃度的比值有利于提高PGL酶活和生產(chǎn)強(qiáng)度； 3)菌體生長階段采用甘油指數(shù)流加策略

5、，能在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)菌體生長最大化。指數(shù)流加甘油19h，菌體濃度可達(dá)到140g/L，細(xì)胞生產(chǎn)強(qiáng)度是DO—stat法的3.4倍； 4)甲醇的誘導(dǎo)階段采用甲醇分階段流加策略，成功地將甲醇與菌體濃度比例控制在0.163～0.171g/g。PGL酶活最高達(dá)430U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到4.34U/mL/h，產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別是DO—star法的2.2倍和2.4倍，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強(qiáng)度生產(chǎn)PGL； 5)通過考察誘導(dǎo)溫度發(fā)現(xiàn)：當(dāng)

6、誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)，整個(gè)過程中細(xì)胞干重基本維持在122g/L，而在低溫(26℃和22℃)下，菌體明顯呈現(xiàn)出生長現(xiàn)象，菌體濃度分別增加到147g/L和148g/L。并且低溫對(duì)PGL表達(dá)具有極大的促進(jìn)作用。誘導(dǎo)溫度為22℃時(shí)，PGL最高酶活達(dá)922U/mL，分別是30℃(322U/mL)和26℃(657U/mL)的2.9倍和1.4倍； 6)在甲醇的非限制狀態(tài)下，溫度成為影響細(xì)胞活力的關(guān)鍵因素。通過檢測發(fā)酵液中細(xì)胞活性和總蛋白酶活，發(fā)

7、現(xiàn)：低度有利于增加細(xì)胞活力和降低細(xì)胞的死亡率。在低溫下誘導(dǎo)，發(fā)酵上清液中幾乎檢測不到蛋白酶；而在高誘導(dǎo)溫度(30℃)下，蛋白酶活性明顯增大，加劇了PGL的降解； 7)降低誘導(dǎo)溫度使胞內(nèi)AOX酶活性大幅度增加，從而增強(qiáng)了目的蛋白PGL的表達(dá)。另外，低溫下胞內(nèi)參與能量代謝的各腺苷酸類物質(zhì)(ATP、ADP、AMP)的含量同樣也顯著提高，在細(xì)胞適應(yīng)甲醇后的20h～40h內(nèi)，能荷迅速降低，用作碳流轉(zhuǎn)變的信號(hào)或直接用作調(diào)控重組蛋白質(zhì)的合成。