IL-1Ra在畢赤酵母中的高密度發(fā)酵、分離純化和生物學(xué)作用研究.pdf

1、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(interleukin1 receptor antagonist，IL-1Ra)是天然的受體拮抗劑，可與白細(xì)胞介素1(interleukin1，IL-1)的受體結(jié)合但不引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制IL-1與其受體結(jié)合所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，有效降低IL-1表達(dá)過(guò)多導(dǎo)致的不良反應(yīng)。本文研究了重組人白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(recombinant human interleukin1 receptorantagonist,

2、 rhIL-1Ra)的畢赤酵母工程菌在不同規(guī)模下的表達(dá)條件、分離純化工藝以及生物學(xué)作用。
　　首先，本文研究了1L搖瓶規(guī)模下不同誘導(dǎo)溫度和pH對(duì)rhIL-1Ra表達(dá)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhIL-1Ra在pH為5.5、誘導(dǎo)溫度28℃條件下表達(dá)量達(dá)到最高，兩種形式（糖基化和非糖基化）的rhIL-1Ra表達(dá)量分別為12和10 mg/L。
　　其次，本文在搖瓶條件基礎(chǔ)上對(duì)3L發(fā)酵罐規(guī)模下rhIL-1Ra的最優(yōu)表達(dá)條件進(jìn)行研究，包括:

3、起始誘導(dǎo)菌體密度、溶氧、溫度、pH、甲醇濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。確定的最佳表達(dá)條件為:起始誘導(dǎo)時(shí)發(fā)酵液光密度(OD600)為600，溶氧為20％，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)pH5.0，誘導(dǎo)時(shí)間6d，甲醇濃度0.25％。在最優(yōu)條件下，糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的表達(dá)量分別達(dá)到110和90 mg/L。
　　再次，本文對(duì)rhIL-1Ra的分離純化工藝進(jìn)行了研究。確定的最優(yōu)工藝為:低溫離心→雙水相萃取→超濾→DEAE-陰離子交換層析→SP-陽(yáng)離子

4、交換層析等，最終得到純度大于95％，收率分別達(dá)到56％、40％的糖基化和非糖基化rhIL-1Ra。
　　最后，本文利用MTT和Hoechst33258染色分別測(cè)定了糖基化和非糖基化rhIL-1Ra對(duì)rhIL-1β促進(jìn)B16細(xì)胞凋亡的拮抗作用。結(jié)果表明，兩種形式的rhIL-1Ra對(duì)rhIL-1β均有拮抗作用，且隨著rhIL-1Ra濃度的升高，對(duì)IL-1β的拮抗作用越明顯。
　　綜上，本文研究了rhIL-1Ra的畢赤酵母工程菌在

5、不同規(guī)模下表達(dá)條件優(yōu)化，rhIL-1Ra的分離純化和生物學(xué)作用，并首次研究了糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的生物學(xué)作用差異。其中，糖基化和非糖基化rhIL-1Ra在3L規(guī)模下均得到較高的表達(dá)量(110和90 mg/L)，建立了糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的分離純化工藝，獲得純度大于95％，收率達(dá)到56％的糖基化rhIL-1Ra，純度大于95％，收率達(dá)到40％的非糖基化rhIL-1Ra;對(duì)糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的生物學(xué)作用