巴氏畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵表達重組人源膠原蛋白.pdf

1、膠原蛋白具有良好的生物相容性、低免疫原性和可生物降解性等優(yōu)良特性，因而在生物醫(yī)藥、組織工程、食品、化妝品等領域有著廣泛的應用。目前市售的膠原蛋白產(chǎn)品主要是采用酸堿水解法或酶解法從動物皮、骨等組織中提取。由于這些方法制取的產(chǎn)品存在的固有缺陷使其在作為醫(yī)藥、生物醫(yī)學材料或藥物載體等方面的應用受到很大限制。本文利用現(xiàn)代生物技術，通過基因工程菌表達和制備重組人源膠原蛋白，主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.利用本實驗室構(gòu)建的巴氏畢赤酵母基因工

2、程菌表達重組人源膠原蛋白，采用超聲波法低溫間歇處理破碎細胞，通過SDS-PAGE檢測確定重組人源膠原蛋白的表達形式。
　　 2.采用響應面法(response surface methodology,RSM)優(yōu)化巴氏畢赤酵母搖瓶發(fā)酵條件。
　　 3.基于甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母在發(fā)酵罐中表達外源蛋白的特點，利用響應面法優(yōu)化的發(fā)酵條件，在3.7L自控發(fā)酵罐和12.5L自控發(fā)酵罐上進行高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化。對優(yōu)化工藝條件下的高密度發(fā)

3、酵進行動力學分析，建立了甲醇誘導表達階段的菌體生長模型、產(chǎn)物形成模型和基質(zhì)消耗模型。
　　 4.采用硫酸銨鹽析法、Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂柱層析和Sephadex G100凝膠過濾層析組合方法、一步Sephadex G100凝膠過濾層析三種方案對表達產(chǎn)物進行分離純化。
　　 5.利用氨基酸分析儀、MALDI-TOF-MS，紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜以及掃描電鏡等儀器對純化后的表達產(chǎn)物重組

4、人源膠原蛋白進行結(jié)構(gòu)表征，并對其進行水溶性、成膜性能、黏度以及生物活性檢測以考察其作為生物醫(yī)學材料等方面應用的潛質(zhì)。
　　 6.利用模擬空間環(huán)境，在高磁場和微重力條件下，探討巴氏畢赤酵母基因工程菌表達重組人源膠原蛋白的生物學效應。
　　 7.利用表達產(chǎn)物重組人源膠原蛋白與殼聚糖復合制備生物醫(yī)學納米材料，通過紅外光譜、掃描電鏡和透射電鏡等儀器對其分析表征。
　　 本文利用巴氏畢赤酵母基因工程菌優(yōu)化表達重組人源膠原蛋