普魯蘭酶畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建和定點(diǎn)突變改造.pdf

1、在淀粉質(zhì)原料的水解過程中，普魯蘭酶與其他淀粉酶類的協(xié)同作用，可以提高淀粉原料中支鏈淀粉的降解率，因此受到廣泛的應(yīng)用。
　　本研究挑選來源于Bacillus acidopullulyticus菌株的Ⅰ型普魯蘭酶基因pul13進(jìn)行異源表達(dá)，采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變對(duì)酶進(jìn)行性質(zhì)的改造。
　　主要研究?jī)?nèi)容有:
　　(1)普魯蘭酶基因序列的優(yōu)化、拼接、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究
　　根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性優(yōu)化該基因序列，利用

2、Daul asymmetricPCR和Overlap extension PCR將這些短的核苷酸序列拼接成全長(zhǎng)普魯蘭酶基因序列，并利用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母X-33菌株中。
　　重組普魯蘭酶的最適作用溫度和pH分別為60℃和4.0-5.0。在溫度低于60℃時(shí)，酶的活性能夠保持在最高酶活的70％以上，但是在高于60℃時(shí)酶活力急劇下降。在pH低于2.0或者高于7.0時(shí)基本喪失酶活性，在不同pH緩沖液下4℃處理1h后，在pH3.0-

3、6.0有較好的穩(wěn)定性。1mM的金屬離子Ca2+、Mg2+、Fe3+和Fe2+對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用，Na+和K+對(duì)酶活性沒有較大的影響，EDTA、Cu2+、Ba2+和SDS對(duì)酶有抑制作用。在以普魯蘭多糖為底物條件下重組酶的米氏常數(shù)Km為0.26 mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax為2.32μmol· min-1· mg-1。
　　(2)普魯蘭酶定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇及構(gòu)建
　　對(duì)普魯蘭酶的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，選取了催化活性口袋附近

4、的5個(gè)loop為突變位點(diǎn)，突變?yōu)镵lebsiella pneumoniae普魯蘭酶氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的氨基酸。此外，選取位于催化口袋底部487位點(diǎn)的谷氨酰胺和半保守位點(diǎn)495位點(diǎn)的天冬酰胺均突變?yōu)楸彼幔∕1和M2）。采用重疊延伸PCR的方法進(jìn)行基因序列的定點(diǎn)突變，構(gòu)建7種突變基因的畢赤酵母表達(dá)菌株。
　　(3)定點(diǎn)突變改造的重組酶的性質(zhì)研究
　　通過與野生型普魯蘭酶的性質(zhì)的比較，突變普魯蘭酶Pul13M1的比活力從2.21