菠蘿葉纖維脫膠畢赤酵母工程菌的構(gòu)建、表達(dá)以及應(yīng)用.pdf

1、菠蘿葉纖維作為新型紡織材料,對(duì)它脫膠的研究已經(jīng)引起人們的關(guān)注。果膠裂解酶具有降解果膠的作用,木聚糖酶具有降解半纖維素的主要組成部分木聚糖的作用,因此,果膠裂解酶和木聚糖酶在脫膠的過程中起關(guān)鍵性的作用。本室已在大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達(dá)了果膠裂解酶PelC,并且保留了表達(dá)載體pPIC9K-PelC和果膠裂解酶畢赤酵母工程菌P2。本文在此基礎(chǔ)上,從綠色木霉(AS3.3711)中克隆了果膠裂解酶基因xyn2,并將xyn2克隆到酵母穿梭型表達(dá)載體p

2、PIC9K,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPIC9K-xyn2。將pPIC9K-xyn2線性化,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,并且將pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC同時(shí)轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,通過組氨酸營養(yǎng)缺陷型篩選,G418高拷貝菌株篩選,以及搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)篩選,分別得到一株高表達(dá)木聚糖酶畢赤酵母菌株X5和一株同時(shí)高表達(dá)木聚糖酶和果膠裂解酶畢赤酵母菌株P(guān)X6。
　　 對(duì)P2、X5、PX6誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果表

3、明:木聚糖酶畢赤酵母工程菌X5分泌表達(dá)木聚糖酶,分子量為21KD;果膠裂解酶畢赤酵母工程菌P2分泌表達(dá)果膠裂解酶,分子量為43KD;果膠裂解酶和木聚糖酶雙價(jià)工程菌PX6分泌表達(dá)果膠裂解酶和木聚糖酶,分子量分別為43KD和21KD。對(duì)P2、X5、PX6誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶的活力測定以及性質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)果膠裂解酶畢赤酵母工程菌P2分泌表達(dá)果膠裂解酶,活力最高為14.2 U/ml;木聚糖酶畢赤酵母工程菌X5分泌表達(dá)木聚糖酶,活力最高為5.8U/m

4、l;果膠裂解酶和木聚糖酶雙價(jià)工程菌PX6分泌果膠裂解酶活力最高為12.6 U/ml,木聚糖酶活力最高為4.2 U/ml。果膠裂解酶的最適作用溫度為50℃,最適pH值為5.4;木聚糖酶的最適作用溫度為50℃,最適pH值為6.0。
　　 將雙價(jià)工程菌PX6發(fā)酵生產(chǎn)出高活性的果膠裂解酶和木聚糖酶。用正交的方法確定了菠蘿葉纖維脫膠的優(yōu)化工藝參數(shù)為:時(shí)間4h,粗酶液用量為12％,pH值為5.5,溫度為50℃。脫膠后的結(jié)果表明:纖維素的含量