畢赤酵母工程菌pk53產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵的優(yōu)化研究.pdf

1、人體內(nèi)的血栓常引發(fā)嚴(yán)重的心血管疾病,發(fā)病突然,死亡率極高,溶栓治療是搶救與治療此類(lèi)疾病的常用手段。纖溶酶則能分解血栓的主要骨架纖維蛋白從而溶解血栓,以恢復(fù)血流通暢、促進(jìn)組織恢復(fù)。該酶在發(fā)揮溶栓作用時(shí),不水解血漿纖維蛋白質(zhì),故不易引起出血傾向。因此纖溶酶具有廣闊的研究開(kāi)發(fā)前景。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。能使外源真核基因正確地翻譯和翻譯后加工,并能對(duì)許多蛋白質(zhì)產(chǎn)物

2、進(jìn)行分泌,使產(chǎn)物易于提純。目前畢赤酵母工程菌搖瓶培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基價(jià)格昂貴,本試驗(yàn)在前期已構(gòu)建產(chǎn)纖溶酶的基因工程菌菌株基礎(chǔ)上,對(duì)產(chǎn)纖溶酶畢赤酵母基因工程菌的培養(yǎng)基進(jìn)行探索研究,找到了一種廉價(jià)的培養(yǎng)基配方,降低了纖溶酶的生產(chǎn)成本,并對(duì)其液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化及10L發(fā)酵罐的放大試驗(yàn)。
　　 本文在搖瓶發(fā)酵水平上,對(duì)產(chǎn)纖溶酶畢赤酵母工程菌菌株pk53研究了不同碳源、氮源、磷酸鹽、金屬離子、表面活性劑等因素對(duì)畢赤酵母工程菌菌株pk53產(chǎn)

3、酶的影響,發(fā)現(xiàn)麩皮、豆粕粉、磷酸二氫鉀濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響較大。對(duì)麩皮、豆粕粉、磷酸二氫鉀三因素各選取三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn),利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定確定了其最佳培養(yǎng)基成分。確定該菌株的適宜廉價(jià)發(fā)酵培養(yǎng)基為:麩皮1.5％,豆粕粉2.0％,KH2PO40.5％,MgSO4·7H2O0.05％；分別考察了接種量、甲醇添加量、起始pH值、誘導(dǎo)pH值、裝液量等發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響,確定其最佳培養(yǎng)條件為:接種齡14 h,接種量1％,甲醇添加量1

4、.5％,培養(yǎng)基裝液量30 mL(250mL三角瓶),生長(zhǎng)pH為5.5,誘導(dǎo)pH為6.0；設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)來(lái)綜合考慮甲醇添加量、誘導(dǎo)pH、培養(yǎng)基起始PH、裝液量四個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)極差值R裝液量>R甲醇添加量>R誘導(dǎo)pH>R初始pH,根據(jù)單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果,確定發(fā)酵條件優(yōu)化配比為:裝液量30 mL、甲醇添加量1.5％、誘導(dǎo)pH6、初始pH5.5。在此條件下培養(yǎng),最大酶活為1841.28 U／ml,是出發(fā)菌株酶活力的3.02倍,且產(chǎn)